[发明专利]芒果畸形病病原菌（Fusarium mangiferae）分子快速检测的方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种芒果畸形病病原菌（Fusarium mangiferae）分子快速检测的方法与应用，即利用一对特异性引物和聚合酶链式反应（PCR）分子生物技术对芒果畸形病病原菌（Fusarium mangiferae）进行高灵敏度快速检测，同时可用于田间芒果畸形病的早期诊断和病菌的检测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治领域。 

背景技术

芒果畸形病 (mango malformation disease，MMD)，又称簇生病、簇芽病，由镰刀菌或是其复合体引发致病。目前，国内外报道较多的并且通过柯赫法则验证的病原菌有6种，分别为：Fusarium subglutinans，Fusarium mangiferae，Fusarium proliferatum，Fusarium sterilihyphosum，Fusarium mexicanum sp. nov. 和Fusariumtupiense，其中F. mangiferae危害范围最广，并于2010年被杨顺锦等人确定为我国芒果畸形病的病原菌。该病分为枝叶畸形和花序畸形。感染该病后，病株花序变密，簇生，畸形花序呈拳头状；嫩梢腋芽与顶芽丛生，节间变粗、变短，叶片变厚、变窄、变脆，最后干枯；果实变黑变小，不发育，甚至不座果，为害可导致减产30%~90%，一般单株受害程度50%～80％，严重者达100%，每年都造成巨大的经济损失。在我国，该病最早发生于云南元江西北灌渠，发病株率达75.4%。2011年，杨顺锦等人发现该病害在金沙江干热河谷地区某些果园的芒果也日趋严重，发病株率达30%~60%，有的甚至高达95%。除此之外，该病害在四川攀枝花，云南元谋、华坪和广西部分地区的芒果园也有流行，个别果园为害严重，有蔓延趋势，对我国芒果产业造成直接的威胁。 

芒果畸形病病原菌潜伏期长，一旦发病，难于治理，所以建立快速检测手段具有重要的意义。在国外，Zvi Newman等在2012年运用了AFLP技术筛选到了4对引物，并对芒果畸形病病原菌Fusarium mangiferae 建立了一个快速诊断技术，该诊断技术同时适用于离体和活体检测，能检测到真菌DNA的含量最低为10pg，但是AFLP技术操作复杂，检测周期较长，且实验并未涉及中国芒果畸形病病原菌的检测，在推广方面受到限制。在国内，贾静等于2013年利用Fusarium proliferatum的钙调蛋白基因序列设计了一对内侧引物和一对外侧引物，通过巢式PCR建立了芒果畸形病病原菌Fusarium proliferatum的检测方法，灵敏度达到5×10^-5 ng/μL。该方法主要对比了巢式PCR与普通PCR检测结果的差异，虽然巢式PCR灵敏度高，但是其操作不及普通PCR简单，且该检测在普遍性和特异性方面缺乏说服力。为了防止芒果畸形病从疫区传入非疫区，确保国内芒果的安全生产，建立一种针对国内芒果畸形病病原菌Fusarium mangiferae的稳定、简单、快速、灵敏的分子检测方法已经迫在眉睫。 

发明内容

本发明的主要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种针对中国芒果畸形病病原菌（Fusarium mangiferae）的分子快速检测的方法。 

本发明的另一目的在于提供所述方法特异性引物及在芒果畸形病病原菌分子快速检测中的应用。 

本方法的目的通过下述技术方案实现：一种芒果畸形病病原菌（Fusarium mangiferae）分子快速检测的方法，包括以下步骤： 

（1）根据ISSR分子标记筛选引物和目的片段，分析比对目的序列并设计SCAR检测特异性引物，其中：

上游引物W342：5^，-ACAACTCCGCACCCTCAATG-3^，；

下游引物W1772：5^，-GGACCCTCAGACTGCCCAAT-3^，。