[发明专利]一株明串珠菌突变菌株及其构建方法和应用方法

权利要求书

1.一株明串珠菌突变菌株，其特征在于：是葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突变菌株，为肠膜明串珠菌Δdtsl（Leuconostoc MesenteroidesΔdtsl）菌株,其在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏日期是2014年01月03日，保藏号是CCTCCM2013724。

2.权利要求1所述一株明串珠菌突变菌株的构建方法，其特征在于：通过基因敲除手段使明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因失活而构建成为明串珠菌突变菌株即肠膜明串珠菌Δdtsl（Leuconostoc MesenteroidesΔdtsl，保藏号是CCTCCM2013724）菌株，步骤如下：

第一步，明串珠菌葡聚糖蔗糖酶基因部分序列的克隆

将基因编码序列长度超过4kb的肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides，保藏日期为2009年12月31日，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏编号为CGMCC1.10327）的葡聚糖蔗糖酶分成2段克隆后拼接成ORF内的部分连续序列，具体操作步骤是：

（1）保藏编号为CGMCC1.10327的肠膜明串珠菌总DNA的提取，

（2）PCR扩增葡聚糖蔗糖酶基因，

（3）感受态大肠杆菌DH5α的制备和DNA转化；

第二步，同源重组载体的构建

（1）设计二对引物Dtsqt1与Dtsqt2和Dtsht1与Dtsht2，分别以其中的一个片段的重组质粒为模板进行PCR扩增，

（2）以纯化的PCR产物混合物为模板，利用一对引物Dtsqt1和Dtsht2再进行PCR扩增，

（3）将重叠延伸PCR产物和pUC19用KpnI和SalI进行双酶切后，两者在T4-DNA连接酶的作用下连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组质粒pUC19-Dtsqh，即构建为同源重组载体；

第三步，葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突变菌株的构建

以电击转化法将第二步得到的同源重组载体导入到肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides，保藏日期为2009年12月31日，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏编号为CGMCC1.10327）中，从平板上筛选葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突变菌株，设计一对引物Dtsy1和Dtsy2，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，验证证明构建得到葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdtsl（Leuconostoc MesenteroidesΔdtsl，保藏号是CCTCCM2013724）菌株。

3.权利要求1所述一株明串珠菌突变菌株的应用方法，其特征在于：将明串珠菌突变菌株即肠膜明串珠菌Δdtsl（Leuconostoc MesenteroidesΔdtsl，保藏号是CCTCCM2013724）菌株以重量百分比1%转接到MRS培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20h，检测代谢产物，通过对比试验证明，该明串珠菌突变菌株的甘露醇产率比原始肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides，保藏编号为CGMCC1.10327）提高了15.3%，蔗糖中果糖部分的转化率提高了6.1%。

4.根据权利要求3所述权利要求1所述一株明串珠菌突变菌株的应用方法，其特征在于：所述MRS培养基的的组成为：酵母浸粉2克、蔗糖20克、柠檬酸铵2克、乙酸钠5克、K₂HPO₄2克、MnSO₄·H₂O0.039克、吐温800.4毫升和水1000毫升，用乙酸调pH到6.2，在121℃，灭菌20分钟。