[发明专利]一株明串珠菌突变菌株及其构建方法和应用方法

说明书

技术领域

本发明的技术方案涉及细菌，具体地说是一株明串珠菌突变菌株及其构建方法和应用方法。 

背景技术

甘露醇被广泛的应用于医药、食品、化工和电子等行业。全球甘露醇消费量约占多元醇总量的11%，每年约为15万吨。美国是甘露醇的最大消费国。其它如欧洲国家，用于生产口香糖、口含片、嘴嚼片的用量均较大。我国目前甘露醇消费主要是直接用于生产甘露醇注射液、药品辅助添加剂和无糖型食品添加剂等。由于食品行业尤其是口香糖对甘露醇需求量快速增加，甘露醇市场容量迅速扩大。甘露醇在医药行业用量较大，目前我国仅甘露醇注射液每年就要消耗甘露醇4500吨，2003年医药行业消费甘露醇5600吨。近年来我国肥胖和糖尿病较为严重，而且有越来越严重的趋势，因此对无糖并具有营养的甜味剂甘露醇需求潜力巨大，2004年我国食品及其添加剂领域对甘露醇的需求量约3000吨。 

目前，虽然有多种生产甘露醇的方法，但其中以微生物发酵法有着明显的优势。很多菌株以果糖为底物发酵产生甘露醇，而明串珠菌将果糖和蔗糖都可以作为底物产生甘露醇。廉价的蔗糖进入明串珠菌胞内后，分解成1-磷酸葡萄糖和果糖，果糖再转化为甘露醇，反应步骤相对少；而同型乳酸发酵的乳杆菌中葡萄糖经6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖和1-磷酸甘露醇等中间产物最终转化为甘露醇，反应步骤相对多；因此明串珠菌实现大规模工业化生产甘露醇的潜力比乳杆菌大。 

然而，现有的明串珠菌发酵技术中，蔗糖既可以直接进入胞内转化为甘露醇，又可以在胞外葡聚糖蔗糖酶的作用下产生葡聚糖和果糖，果糖进入胞内参与碳代谢也可以转化为甘露醇，因此在胞外葡聚糖蔗糖酶的作用使甘露醇的产率下降。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一株明串珠菌突变菌株及其构建方法和应用方法，该明串珠菌突变菌株是葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突变菌株，基于同源重组，通过把基因敲除手段使明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因失活，进而阻碍葡聚糖合成途径，从而克服了微生物发酵法生产甘露醇中成本过高的瓶颈问题，结果使甘露醇产率比原始菌株提高了15.3%，蔗糖中果糖部分的转化率提高了6.1%。 

本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：一株明串珠菌突变菌株，是葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突变菌株，为肠膜明串珠菌Δdtsl，即Leuconostoc Mesenteroides  Δdtsl菌株,其在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏日期是2013年12月29日，保藏号是CCTCCM2013724。 

一株明串珠菌突变菌株的构建方法，通过基因敲除手段使明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因失活而构建成为明串珠菌突变菌株即肠膜明串珠菌Δdtsl（即Leuconostoc Mesenteroides Δ dtsl，保藏号是CCTCCM2013724）菌株，步骤如下： 

第一步，明串珠菌葡聚糖蔗糖酶基因部分序列的克隆 

将基因编码序列长度超过4kb的肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides，保藏日期为2009年12月31日，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏编号为CGMCC1.10327）的葡聚糖蔗糖酶分成2段克隆后拼接成ORF内的部分连续序列，具体操作步骤是： 

（1）保藏编号为CGMCC1.10327的肠膜明串珠菌总DNA的提取， 

（2）PCR扩增葡聚糖蔗糖酶基因， 

（3）感受态大肠杆菌DH5α的制备和DNA转化； 

第二步，同源重组载体的构建 

（1）设计二对引物Dtsqt1与Dtsqt2和Dtsht1与Dtsht2，分别以其中的一个片段的重组质粒为模板进行PCR扩增， 

（2）以纯化的PCR产物混合物为模板，利用一对引物Dtsqt1和Dtsht2再进行PCR扩增， 

（3）将重叠延伸PCR产物和pUC19用KpnI和SalI进行双酶切后，两者在T4-DNA连接酶的作用下连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组质粒pUC19-Dtsqh，即构建为同源重组载体； 

第三步，葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突变菌株的构建