[发明专利]利用Pto/AtBI-I双价基因在促进红豆杉生长和提高紫杉醇含量中的应用及方法

权利要求书

1.Pto/AtBI-1双价基因在促进红豆杉生长和提高紫杉醇含量中的应用。

2.利用Pto/AtBI-1双价基因促进红豆杉生长和提高紫杉醇含量的方法，其特征在于该方法包括：将目的基因Pto和AtBI-1连接到具有35S启动子的表达载体质粒中，构建Pto/AtBI-1双价基因重组质粒，采用农杆菌介导法将Pto/AtBI-1双价基因重组质粒导入红豆杉细胞中，筛选稳定表达的阳性克隆并进行分化培养，以获得生长快而且紫杉醇含量高的转基因红豆杉植株，具体包括以下步骤：

1）目的基因扩增：以含有Pto cDNA序列的pET112-pto质粒为模板，PCR产物电泳后回收扩增的Pto基因，备用；以含有AtBI-1 cDNA序列的pYX112-AtBI-GFP质粒为模板，PCR产物电泳后回收扩增的AtBI-1基因，备用；反应程序为：95℃变性1min、60℃退火45s，72℃延伸1min，29个循环；

2）启动子回收：在20μl反应体系中加入含有35S启动子的pCD782质粒DNA 5μg，2μl 10×相应酶切缓冲液，1μl限制性内切酶，用无菌水补至20μl，在37℃±1℃下反应3h后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，切出含有35S启动子的大片段和GFP小片段，将含有35S启动子的pCD782片段回收，备用；

3）将步骤2）获得的含有35S启动子的pCD782片段首先和步骤1）获得的Pto DNA连接，连接后的产物命名为pCM-pto； 

4）在20μl反应体系中加入步骤3）获得的pCM-pto DNA 5μg，2μl酶切缓冲液，1μl限制性内切酶，用无菌水补至20μl，在37℃±1℃下反应3h后，进行琼脂糖凝胶电泳回收pCM-pto酶切DNA片段，备用；

5）将步骤4）获得的pCM-pto酶切DNA片段与步骤1）获得的AtBI-1 DNA连接，连接后的产物命名为pCM-pto/atbi-1；

6）pCM-pto/atbi-1转化农杆菌：

挑取EHA105单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃下300rpm振荡培养30-36h，得菌液A；将菌液A以1：100的比例接种于LB液体培养基中，37℃下300rpm振荡培养2-3h，至OD₂₆₀=0.5左右，得菌液B；取菌液B1.5ml于Eppendorf管中，冰上放置10min后，3000rpm、4℃离心，去掉上清，得沉淀；取经过冰预冷的0.05 M 的CaCl₂溶液1ml重悬沉淀，冰上放30min后，3000rpm、4℃离心10min，弃去上清，并加入60μl灭菌甘油，340μl 0.05M的CaCl₂于沉淀中，轻轻振荡使细胞重悬浮，并于冰上放置30min后获得感受态细胞；取感受态细胞200μl，加入10μl连接后的pCM-pto/atbi-1 DNA溶液，摇匀后于冰浴中放置30min，42℃水浴热激90秒，然后迅速放冰上5min，加入800μl液体LB培养基，于37℃下振荡1 h，使细胞恢复正常生长状态，得转化态农杆菌菌液；取100μl转化态农杆菌菌液均匀涂布于含壮观霉素及潮霉素的LB固体培养基上，37℃培养16-24 h；挑取长出的抗性单菌落划线，扩增，进行菌落PCR鉴定，获得的阳性菌落用于红豆杉细胞的遗传转化；

7）红豆杉细胞遗传转化：

取阳性农杆菌40μl接种至10ml LB三角瓶中，于250rpm，28℃下培养，至菌液的OD₂₆₀值在0.8-1.0，移取1ml上述菌液至50 ml新鲜的LB液体培养基中，于250rpm，28℃下培养24h，得到菌液C；吸取上述菌液C 500μl于50ml MS液体培养基中混匀得农杆菌悬浮液，取2-5mg红豆杉愈伤细胞置于5ml农杆菌悬浮液中1-2min，轻轻振荡2-3次，以无菌滤纸过滤并以10ml含200mg/L头胞霉素的MS液体培养基清洗3-4次后，将侵染的红豆杉愈伤细胞接种到含潮霉素40 mg/L的MS培养基中，28℃、140rpm黑暗培养10天，获得具有潮霉素抗性的转基因红豆杉愈伤细胞； 

8）转基因红豆杉植株再生：将步骤7)获得的转基因红豆杉愈伤细胞按0.05mg/ml比例接种到传代培养基中进行分化培养，照光16h/天，光强度为4000lx，25℃下培养2周，获得分化植株。