[发明专利]利用Pto/AtBI-I双价基因在促进红豆杉生长和提高紫杉醇含量中的应用及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用Pto/AtBI-1双价基因在促进红豆杉生长和提高紫杉醇含量中的应用及方法。

背景技术

以药用植物为主的天然药物产业是国家十二五重点支持产业和浙江省十二五农业十大主导产业之一。药用植物不仅可作为化学药品的原料，而且本身也可以作为中药材料应用于传统医学的保健和治疗中。在药用植物中，药用成分含量是决定其品质和开发利用价值的物质基础。

目前，从植物中提取分离仍是获得许多重要天然药物的最主要途径，然而，大多数天然药物是植物的次生代谢物，其在植物中含量低，且只在植物特殊组织部位、特定生长阶段或生长环境下积累，过度依赖野生植物资源不仅会危及濒危物种，同时也会破坏生态环境。药用植物人工栽培技术在一定程度上可以缓解这些问题，但由于许多药用植物对生长环境要求高、生长周期长、栽培管理劳动量大等原因，使得药用植物栽培成本较高、实际应用时难度较大。

紫杉醇是红豆杉中的一种天然次生代谢产物，近年来研究发现紫杉醇是一种天然高效抗肿瘤药物。由于紫杉醇结构特殊，难以利用普通化学方法进行人工合成，因此通常采用天然红豆杉植物作为分离制备紫杉醇的原料。然而，由于天然红豆杉植物资源有限，各级政府对天然红豆杉资源的开发进行了严格的限制。人工种植红豆杉是解决紫杉醇生产原料问题的重要途径。然而，由于红豆杉生长速度慢，而且人工种植红豆杉中的紫杉醇含量低，使得利用人工种植技术解决紫杉醇生产原料的途径面临很大的经济和技术问题。

包括紫杉醇在内的许多次生代谢产物是植物在长期进化过程中与环境相互作用的结果，其产生和变化与环境有较强的相关性和对应性，并且大部分具有生物活性的次生代谢产物在植物体内的主要功能与提高植物的抗逆性有关。植物的生存环境并不总是适宜的，植物生长发育的过程中经常受到各种环境胁迫，也称逆境。近年来，不少学者就环境胁迫对药用植物次生代谢产物积累的影响进行了研究，并且发现一些人工逆境胁迫可以提高药用植物中次生代谢产物的含量，然而这些人工逆境胁迫往往同时会对药用植物的生长产生严重的不利影响，因此这些技术在生产实践中往往没有实际使用价值。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种利用Pto/AtBI-1双价基因在促进红豆杉生长和提高紫杉醇含量中的应用及方法。

所述Pto/AtBI-1双价基因在促进红豆杉生长和提高紫杉醇含量中的应用。

所述利用Pto/AtBI-1双价基因促进红豆杉生长和提高紫杉醇含量的方法，其特征在于该方法包括：将目的基因Pto和AtBI-1连接到具有35S启动子的表达载体质粒中，构建Pto/AtBI-1双价基因重组质粒，采用农杆菌介导法将Pto/AtBI-1双价基因重组质粒导入红豆杉细胞中，筛选稳定表达的阳性克隆并进行分化培养，以获得生长快而且紫杉醇含量高的转基因红豆杉植株，具体包括以下步骤：

1）目的基因扩增：以含有Pto cDNA序列的pET112-pto质粒为模板，PCR产物电泳后回收扩增的Pto基因，备用；以含有AtBI-1 cDNA序列的pYX112-AtBI-GFP质粒为模板，PCR产物电泳后回收扩增的AtBI-1基因，备用；反应程序为：95℃变性1min、60℃退火45s，72℃延伸1min，29个循环；

2）启动子回收：在20μl反应体系中加入含有35S启动子的pCD782质粒DNA 5μg，2μl 10×相应酶切缓冲液，1μl限制性内切酶，用无菌水补至20μl，在37℃±1℃下反应3h后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，切出含有35S启动子的大片段和GFP小片段，将含有35S启动子的pCD782片段回收，备用；

3）将步骤2）获得的含有35S启动子的pCD782片段首先和步骤1）获得的Pto DNA连接，连接后的产物命名为pCM-pto； 

4）在20μl反应体系中加入步骤3）获得的pCM-pto DNA 5μg，2μl酶切缓冲液，1μl限制性内切酶，用无菌水补至20μl，在37℃±1℃下反应3h后，进行琼脂糖凝胶电泳回收pCM-pto酶切DNA片段，备用；

5）将步骤4）获得的pCM-pto酶切DNA片段与步骤1）获得的AtBI-1 DNA连接，连接后的产物命名为pCM-pto/atbi-1；

6）pCM-pto/atbi-1转化农杆菌：