[发明专利]大脑皮层神经元分离和原代培养方法

权利要求书

1.一种大脑皮层细胞的分离和原代培养方法包括以下步骤： 

(1)漂洗：取离体哺乳动物的大脑皮层组织，置冰浴的漂洗液中，去除红细胞、被膜及结缔组织，用漂洗液冲洗2～5次； 

(2)消化：将步骤1漂洗后的大脑皮层组织剪成直径1mm³小块，用5倍组织体积的消化液37℃作用5～10分钟，组织成粥糜状，用细胞种植液终止消化，轻轻吹打至组织块10次以分散细胞。 

(3)制备细胞悬液：收集步骤2消化后初次细胞悬液，经200目细胞筛过滤后，800～1000rpm4℃离心5～10分钟，弃去上清液，加入细胞种植液，重悬细胞，制成5×10⁵～10×10⁵个／mL的单细胞悬液； 

(4)接种、培养：将步骤3细胞悬液种植于预先铺好多聚赖氨酸的培养皿及培养瓶中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中，种植后24～72小时换成细胞维持液，之后每隔两天用细胞维持液换液，每次更换的量为原体积的1／2。 

2.根据权利要求1所述的一种大脑皮层细胞的分离和原代培养方法，其特征在于所述漂洗液，经过如下步骤得到：2g海藻糖、3g葡萄糖和10mL双抗溶于100mL D-Hank′s液中，混匀，加D-Hank′s液定容至1000mL，0.4MPa大气压下溶入氢气4～6小时，氢气终浓度达到为0.5mmol／L，γ射线消毒灭菌，分装，4℃保存备用。 

3.根据权利要求1所述的一种大脑皮层细胞的分离和原代培养方法，其特征在于所述消化液，经过如下步骤得：1.0g胰蛋白酶和0.1g EDTA溶于100mL D-Hank′s液中，混匀，加D-Hank′s液定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤除菌，0.4MPa大气压下溶入氢气4～6小时，氢气终浓度达到为0.5mmol／L，γ射线消毒灭菌，分装，4℃保存备用。 

4.根据权利要求1所述的一种大脑皮层细胞的分离和原代培养方法，其特征在于所述细胞种植液，经过如下步骤得到：DMEM／F12培养基加入胎牛血清、活性发酵滤液和双抗，使胎牛血清终浓度为10％、活性发酵滤液终浓度为0.2％，双抗终浓度为1％，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装，4℃保存备用。 

5.根据权利要求1所述的一种大脑皮层细胞的分离和原代培养方法，其特征在于所述细胞维持液，经过如下步骤得到：Neurobasal培养基加入B₂₇和谷氨酰胺，使B₂₇终浓度为2％，谷氨酰胺终浓度1％，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装，4℃保存备用。 

6.根据权利要求2所述的漂洗液，其特征在于所述D-Hank′s液经过如下步骤得到：NaCl8.0g，KCl0.4g，Na₂HPO₄·12H₂O0.12g，KH₂PO₄0.06g，NaHCO₃0.35g；依次将各成分溶解于约500mL三蒸水中混匀，加三蒸水定容至1000mL，调整pH值至7.2～7.4，分装，高压灭 菌，分装，4℃保存备用。 

7.根据权利要求2所述的漂洗液，其特征在于所述双抗是青霉素-链霉素溶液(100×)：青霉素含量为10000U／mL，链霉素含量为10mg／mL。

8.根据权利要求4所述的细胞种植液，其特征在于所述活性发酵滤液经过如下步骤得到： 

①双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)WZ002，该菌株已于2014年1月22日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8809； 

②双歧杆菌WZ002采用改良MRS培养基培养，培养基配方为：以重量计，取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，K₂HPO₄2g，MgSO₄·7H₂O0.5g，MnSO₄·4H₂O0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，吐温-801mL，蒸馏水1L，加热溶解校正pH值至6.5，115℃高压灭菌15-20分钟。 

③将双歧杆菌WZ002接种于冷却至40±2℃的步骤②改良MRS培养基中，菌种接种量为0.2～0.5％，35±2℃厌氧培养24小时，用分光光度计测定上述培养液A_580nm值为1.2时，将上述培养液在转数5000～8500rpm下离心10分钟后，取上清液，0.22μm滤膜过滤除菌，即得到活性发酵液滤液，4℃保存备用。