[发明专利]大脑皮层神经元分离和原代培养方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种大脑皮层细胞分离与原代培养方法及试剂。

背景技术

神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位，是一种已经高度分化的细胞，在哺乳动物出生后很少分裂，因此对神经元的提取有很大的困难。神经元原代培养是将胚胎哺乳动物中枢神经系统的部分组织，如大脑皮层组织、大脑皮层、小脑、下丘脑、海马、脊髓和神经丛从机体直接取出，再接种培养的方法。目前国内、外有关神经元培养的方法较多，但在原代培养中神经元的纯度和产量方面还存在一些急待解决的问题。由于神经元是一种高度分化的细胞，动物出生后很少分裂，相对于其它细胞而言，神经元在体外更难以存活和生长。因此，体外培养神经元要求的培养方法和营养条件均较为特殊。

目前，导致难以获得足够数量和活力的原代大脑皮层细胞元的因素有以下几方面：(1)大脑皮层细胞组织分离过程中，多数人用D-hank′s或hank′s作为漂洗液，离体哺乳动物大脑皮层组织中去除红细胞、被膜及结缔组织等杂质，分离过程时间较长，有时候需要2小时以上，在漂洗液中时间会更长，大脑皮层细胞元即已部分死亡，从而出现假阴性的培养结果。实验上无法开展大脑皮层细胞元的常规培养，主要可能是因为没有合适的用于大脑皮层组织标本的神经元培养用漂洗液／解剖液之故。在组织分离过程中，即使冰浴，神经元依然进行着很大程度代谢，hank′s液的无糖环境对神经元分离很不利，在hank′s液中添加DMEM或者高糖来供给大脑的代谢，但葡萄糖浓度太高，易增加细菌污染的机会；添加DMEM培养液会碱性化，不利于神经元细胞存活。中国专利CN102978162A“一种神经元分离和培养方法及试剂”、中国专利CN102994452A“一种高效分离和培养神经元的方法”和中国专利CN102994451A“一种神经元分离和培养的改进型方法”，取脑组织放入盛有1×PBS的培养皿中，所采用清洗液均为PBS液，DMEM-高糖或DMEM-F12与马血清来浸泡解剖过程中的大脑，来供给大脑的代谢，考虑到了神经元能量代谢需要，但未添加任何抗菌物质，葡萄糖浓度太高，就容易增加细胞污染的机会。(2)采用大剂量胰蛋白酶消化后，大脑皮层细胞势必受到相当程度的生比和机械损害；细胞表面的粘附分子或膜蛋白极易受到破坏，对于这类具有立体结构用以维持细胞增殖及自我更新的细胞来说，很难迅速恢复细胞状态，往往伴随着大范围的细胞死亡／凋亡，细胞“老化”严重，细胞活力将明显减弱，组织中不能获得大量活细胞；(3)细胞种植液对原代培养大脑皮层细胞元至关重要，细胞种植液不同于接下来的细胞维持液，需要给予神经细胞特殊的生长因子，这样才能保证获得足够数量和活力的大脑皮层细胞元。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，本发明提供了一种哺乳动物的大脑皮层细胞元体外原代培养的方法，目的是建立一种简单易行、高纯度的大脑皮层细胞元体外原代培养的方法及试剂，满足神经科学研究的需求。

本发明提供的技术方案之一为：

本发明的双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)WZ002，已于2014年1月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)，保藏编号为CGMCC No.8809。

本发明的双歧杆菌WZ002分离于一名浙江省健康青年人粪便中。

本发明的双歧杆菌WZ002菌株具有下述微生物学特征：

(1)菌落形态：WZ002菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光泽、表面光滑、凸起、质地软、边缘整齐，直径1～1.5mm。

(2)个体形态：G+无芽孢杆菌，杆状。

(3)生理生化特征：D-核糖(+)；L-阿拉伯糖(+)；乳糖(+)；纤维二糖(-)；松三糖(+)；棉籽糖(+)；山梨醇(-)；淀粉(-)；葡萄糖酸钠(-)；木糖(+)；甘露糖(-)；果糖(+)；半乳糖(+)；蔗糖(+)；麦芽糖(+)；海藻糖(-)；密二糖(+)；甘露醇(+)；菊糖(-)；水杨素(-)；F6PPK酶(+)；对氧的反应(在好气固体培养基上不生长)；硝酸盐还原(-)；触酶(-)；靛基质反应(-)。

厌氧下生长良好，有氧环境中不生长。最适生长温度37～41℃；最低生长温度25～28℃；最高43～45℃；生长最适pH6.5～7.0；在pH4.5～5.0或8.0～8.5不生长。