[发明专利]烟草或其制品中可溶性蛋白质含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及烟草的检测技术，具体是一种烟草或其制品中可溶性蛋白质含量的测定方法。

技术背景

在烟叶众多成分中，蛋白质的含量最为丰富，如白肋烟中蛋白质含量高达20.48%。烟叶中的蛋白质分为可溶性蛋白质和不溶性蛋白质。可溶性蛋白质中一半左右是叶绿体蛋白质（Fraction I protein, FI蛋白），另一半为其他可溶性蛋白质的复合物（Fraction II protein, FII蛋白）。研究结果表明，植物叶片中可溶性蛋白质的含量以烟草叶片中含量最高，FI蛋白中的各种必需氨基酸含量不仅均高于世界粮农组织(FAO)制定的蛋白制品中必需氨基酸的含量标准，其中酪氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和亮氨酸都超过该标准一倍左右，比一些主要粮食作物如水稻、小麦、玉米、大豆蛋白质中的必需氨基酸含量都高，表明烟叶中FI蛋白具有较高的营养价值。

目前，植物中可溶性蛋白质的检测方法主要有Lowry法和考马斯亮蓝法，Lowry法具有测定范围窄、使用试剂多、耗时等缺点，而考马斯亮蓝法在一定范围内准确度高，而且前处理相对简单，但大批量检测时比较耗时。有些研究人员采用流动分析法检测烟草中的蛋白质含量，其原理是利用烟草中可溶性蛋白质在0.5%的热醋酸溶液中发生变性沉淀，从而将可溶性蛋白质分离后再测定其中的非蛋白质氮，蛋白质的量由6.25×（总氮—非蛋白质氮）计算烟草中总蛋白质的含量。这种方法根据经验值计算，结果准确度稍差，前处理比较麻烦。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种烟草或其制品中可溶性蛋白质含量的测定方法，该方法利用连续流动分析仪直接检测烟草或其制品中可溶性蛋白质的含量，不需要与标准曲线人为对比，不仅操作简便、自动化程度高、样品回收方便，而且准确率和重复性都较高。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种烟草或其制品中可溶性蛋白质含量的测定方法，包括以下具体步骤： 

（1）称取烟草样品或烟草制品样品0.25～1.0 g，加入蒸馏水25～100 mL溶解，然后超声震荡20～45 min、以3000-10000转/分钟的转速离心5～20 min，将上清液通过中速定量无灰滤纸过滤至样品杯中，得到待测样品溶液；

（2）称取1.0 g牛血清蛋白溶于蒸馏水中，定容至100 mL，中速定量无灰滤纸过滤，得到10 mg/mL的牛血清白蛋白储备液，然后将储备液稀释成浓度为1.0 mg/mL、0.8 mg/mL、0.6 mg/mL、0.4 mg/mL和0.2 mg/mL的牛血清白蛋白标准溶液各100 mL；

（3）量取900 mL无水乙醇加入到1000 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000 mL，中速定量无灰滤纸过滤，得到90%的乙醇溶液；

（4）称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL上述 90%的乙醇中，加入质量浓度850 g/L的磷酸100 mL，最后用蒸馏水定容至1000 mL，加入0.5 mL Brij-35（十二烷基聚乙二醇醚），中速定量无灰滤纸过滤，得到考马斯亮蓝G-250标准溶液；

（5）将牛血清蛋白标准溶液和待测样品溶液分别与考马斯亮蓝G-250标准溶液结合，通过连续流动分析仪的程序运行将各试剂按序进样，在595 nm波长下检测待测样品中可溶性蛋白质的含量。

（6）按YC/T31-1996标准方法测定烟草或其制品样品中的水分含量，进而结合步骤（5）测得的可溶性蛋白质的含量计算待测样品中可溶性蛋白质的绝干含量（质量百分含量）。

可溶性蛋白质的绝干含量W（%）的计算公式为：

式中，c为连续流动分析仪上读出的可溶性蛋白质的含量，单位为g/mL；

V为待测样品溶液的体积，单位为mL；

M为待测样品的质量，单位为g；

W_水为按YC/T31-1996标准方法测得的待测样品的含水量，单位为%。

步骤（5）中连续流动分析仪的进样速率为30～40个样品/小时，进样清洗比例为1:1。

本发明所用试剂除有说明外均采用分析纯试剂，都是用蒸馏水或同等纯度的水配制，使用前都经过中速定量无灰滤纸进行过滤。