[发明专利]具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，属于生物技术领域。 

背景技术

组织创伤或缺损是临床上常见的病症，如创伤引起的器官组织部分缺损，疝气、体表皮肤损伤、烧伤等，严重影响病人的生活质量，是医学上必须面对和亟待解决的难题。目前市场上用于组织修复的材料主要有两类：一类是聚丙烯、聚酯、聚四氟乙烯等高分子合成材料，但因其都是细菌良好的粘附载体，细菌粘附于其上后即可产生使其免受宿主免疫防御机制和抗生素作用的生物被膜，从而得以在局部长期成活并导致伤口的慢性感染，另外其生物相容性不佳，细胞难以长入，无法达到有效的结构和功能重建；另一类是生物衍生材料，由人的异体或哺乳类动物的膜状或者片状组织经理化处理而成的细胞外基质构成，其在组织相容性、稳定性上较合成材料都有较为显著的改善，但是临床应用效果不明显。原因是其制备过程破坏了天然的组织结构及其富含的生长因子等，从而延长组织修复时间或无法达到长期的组织结构替代和功能替代的作用。因而，需要一种生物相容性良好、具备天然组织的三维结构并且富含生长因子的支架材料来满足临床的需要。 

理想的组织工程修复与支架材料应该具备如下的条件：1.有良好的生物相容性和无抗原性，不会与受体发生免疫排斥反应；2.可降解性和降解速率可控性；3.维持生长在其上的细胞形态和表型，并增进细胞的粘附和生长，诱导组织再生最终形成完整的生物组织；4.有一定的空隙率便于组织间的营养和物质空气的交换；5.有一定的机械强度能够对组织起到支持的作用。 

目前关于小肠脱细胞支架的制备工艺过程简单，多局限在单独脱细胞上，总体来说都会存在脱细胞或者消毒不充分的问题，从而导致材料存在一定的免疫原 性和抗原性，同时现有的技术多采用物理和化学联合方法处理小肠，以达到脱细胞去抗原的目的。文献报道，物理和化学联合的方法处理小肠，能够完全去除小肠黏膜中的细胞成分，但同时也存在不少的缺点，如现有技术中机械刮除方法可导致组织结构破坏，支架材料撕裂或破损，甚至断裂，影响后续工艺进行，降低效率。而反复的化学处理可导致支架内的天然生长因子丢失，从而影响细胞生长及组织再生。并且由于传统的方法得到的小肠脱细胞支架没有完整的脉管网络，因此在进行大面积的组织修补时难以形成新生血管，修补的成功率低，效果差。 

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法。本发明所采用的技术方案如下： 

一种具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 

步骤一：取健康成年的哺乳动物麻醉后，肌肉注射抗凝药物，打开腹腔选取一段血供丰富的小肠段，分离小肠的肠系膜根部的动、静脉血管，进行动、静脉血管插管固定并在近心端结扎离断血管； 

步骤二：夹闭小肠段的两端部，离断小肠段的两端部并分别插管固定，分离肠系膜，完整取下所需肠管及肠系膜血管，置于低温环境中，用生理盐水反复冲洗； 

步骤三：依次使用磷酸盐缓冲液、含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲液、十二烷基硫酸钠溶液、磷酸盐缓冲液、聚乙二醇辛基苯基醚溶液、磷酸盐缓冲液分别灌注动脉、静脉、肠管； 

步骤四：灌注完成后使用过氧乙酸和乙醇混合液浸泡消毒，得到小肠脱细胞支架。 

另外，本发明的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤三中所有的PBS溶液的灌注时间为动脉、静脉、肠管各30min，动脉和静脉的灌注速度为3-15ml/min，肠管的灌注速度为50-500ml/min。 

另外，本发明的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，还可以具有这样的特征：其中，含乙二胺四乙酸的胰蛋白溶液的质量体积比为0.25%，灌注时所需温度为37℃，灌注时间为动脉、静脉、肠管各30min，动脉和静脉的灌注速度为3-15ml/min，肠管的灌注速度为50-500ml/min。 

另外，本发明的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，还可以具有这样的特征：其中，十二烷基硫酸钠溶液的质量体积比为0.1%，肠管的灌注时间为8小时，动脉和静脉的灌注时间均为4小时，动脉和静脉的灌注速度为3-15ml/min，肠管的灌注速度为50-500ml/min。