[发明专利]一种从东方伊萨酵母生物转化液中分离纯化胞二磷胆碱的方法

说明书

技术领域

本发明涉及胞二磷胆碱的分离纯化方法，尤其涉及从东方伊萨酵母生物转化液中分离纯化胞二磷胆碱的方法，属于生物分离技术领域。

背景技术

胞二磷胆碱又名胞苷-5’-二磷酸胆碱（Cytidine-5’-diphosphate choline，CDP-c，CDP-胆碱），是磷脂代谢的重要前体及磷脂酰胆碱合成的中间体，为卵磷脂生物合成必需的辅酶，对中枢神经系统损害模型和脑病有显著疗效（Sugino,Biochimica et Biophysica Acta,1960.40:425-434）。研究证明CDP-胆碱能促进生物代谢，尤其是磷脂的生物合成反应（Roe J.H.,Journal of Biological Chemistry,1954.210(2):703-707.）。20世纪50年代kennedy（Kennedy E.P.,Journal of the American Chemical Society,1955.77(1):250-251.）博士等人发现并确定其分子结构，稍后Rossiter（Rossiter,R..,I.McLeod,and K.Strickland,Canadian Journal of Biochemistry and Physiology,1957.35(11):945-951.）等阐明其功能。60年代，日本武田公司研发并用于治疗脑外伤、脑手术等伴随的意识障碍，临床上获得成功，其商品名为Nicholin，中译名尼柯灵(李良铸,李明晔,最新生化药物制备技术.2001:中国医药科技出版社.)。由此，关于胞二磷胆碱的研究在世界范围内展开。我国自上世纪70年代，开发了利用酵母细胞生产胞二磷胆碱的工艺技术(王永智,尉亚辉,聂利芳,西北药学杂志,2009.24(3):235-236.)；华东理工大学牛红星等人，将k-卡拉胶-魔芋-多糖复配胶包埋的啤酒酵母细胞，经冻融处理后用于合成胞嘧啶核苷二磷酸胆碱(牛红星,邱蔚然,丁庆豹,华东理工大学学报,2002.)。

生物合成法制备胞二磷胆碱的反应液中，含有蛋白质、色素、未完全反应的磷酸胆碱钙、胞苷酸、磷酸盐、硫酸镁以及葡萄糖代谢副产物和胞苷等物质，这些杂质给胞二磷胆碱的分离纯化带来很多困难。从上述反应液中提取胞二磷胆碱需要经过菌体和蛋白的去除，769活性炭吸附，离子交换树脂吸附，分步洗脱，碳粉脱色等步骤（黄颖,中国医药工业杂志,1985.1:001.），过程复杂，得率只有45%，损耗严重，反应剩余的胞苷酸没有得以回收利用，不适应于工业大规模生产。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本申请人经过研究改进，提供一种从东方伊萨酵母生物转化液中分离纯化胞二磷胆碱的方法。本发明仅利用一种阴离子交换树脂柱实现了一次性从东方伊萨酵母生物转化液中分离高纯度、高收率的CDP-c及回收未完全反应胞苷酸，操作简便，过程简单，成本低，适应于工业化大规模生产。

本发明的技术方案如下：

一种从东方伊萨酵母生物转化液中分离纯化胞二磷胆碱的方法，包括如下步骤：

（1）将CDP-c含量为0.1～10g/L（优选为2～5g/L）的东方伊萨酵母生物转化液通过强碱或弱碱性阴离子交换树脂柱；

（2）上柱完毕，用去离子水淋洗所述阴离子交换树脂柱，冲洗掉未吸附物质；

（3）用0.01～0.50M的盐溶液洗柱，直至柱出口处流出液不再含有CDP-c，收集洗脱液，得到高纯度CDP-c溶液；

（4）用0.10～1.00M的盐溶液洗柱，直至柱出口处流出液不再含有胞苷酸，收集洗脱液，蒸发浓缩，透析袋去盐，冻干，回收得到胞苷酸。

具体地，步骤（1）所述强碱或弱碱性阴离子交换树脂柱选自大孔苯乙烯系强碱性阴离子交换树脂柱或大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂柱，包括717、D301、D318，颗粒度0.3～1.2mm≥95%，上柱总量为柱交换总量的5～40%（质量比），优选为10～15%（质量比）,柱高径比为10：1～50:1，优选为10：1～20:1。

具体地，步骤（1）所述强碱或弱碱性阴离子交换树脂柱上柱流速为0.2～2mL/min，优选为0.5～1.5mL/min。

优选地，步骤（3）所述盐溶液浓度为0.02～0.20M。

优选地，步骤（4）所述盐溶液浓度为0.20～0.50M。