[发明专利]一种高产丁醇的基因工程菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高产丁醇的基因工程菌株及其应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。

背景技术

丁醇已广泛应用于化工、塑料、油漆等工业领域。丁醇具有能量密度大、可直接用于内燃机、运输方便等优点；作为新型的可再生生物能源，丁醇有着广阔的发展前景。随着化石能源日近枯竭，生物法制备丁醇受到越来越多的关注。生物法制备丁醇一般是利用产丁醇梭菌（丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌等）在严格厌氧条件下进行的，其主要产物是丁醇、丙酮和乙醇，简称ABE发酵。传统的ABE发酵包括产酸期和产溶剂期，丁醇、丙酮和乙醇的比例约为6:3:1。在产酸期，细胞通过乙酸和丁酸的偶联会通过一系列的质子传递体,将两个还原H形成一个H₂释放出菌体。在产溶剂期，产生的乙酸和丁酸在此阶段被转变为溶剂（丙酮、丁醇和乙醇），释放大量CO₂和少量H₂；导致底物的转化利用率仅在35%左右。因此，提高底物转化率和丁醇比例是生物丁醇研究的热点之一。

中国专利ZL95111733.5报道，上海植物生理研究所通过化学诱变的方法得到一株高产丁醇的菌株C.acetobutylicum EA2018，最终发酵产溶剂比为B:A:E=7:2:1，得率在0.35-0.38之间。美国专利US2005/0089979A1报道了利用gas-stripping和连续发酵耦合来生产丙酮丁醇，在1L发酵罐中，以葡萄糖为底物，丁醇比停留在60-70%之间；Mutschlechner等利用拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NRRL B592，通过两阶段调控的方法连续发酵产溶剂，在稳定期丁醇比例的平均值为61%，溶剂产率平均值为0.25。

NADH-辅酶Q氧化还原酶是拜氏梭菌专属的一种位于细胞膜上的质子传递体,作用是以辅酶Q作为质子受体，脱下NADH上一个H,氢气的溢出是菌体维持其内部氧化还原电势稳定的一种方式，然而这种方式造成了还原力的极大浪费，是ABE发酵得率不高的原因之一。可见，利用二型内含子技术阻断位于细胞膜上的还原氢的传递，降低H₂的溢出，提高还原力的利用效率，进而提高丁醇产量，是提高ABE发酵经济性的手段之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高产丁醇的基因工程菌株。

本发明还要解决的技术问题是提供上述基因工程菌株的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述基因工程菌株的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种高产丁醇的基因工程菌，它是在拜氏梭菌中插入失活编码NADH-辅酶Q氧化还原酶关键亚基的基因Cbei_4110从而得到重组菌株。

本发明通过在菌种中失活NADH-辅酶Q氧化还原酶关键亚基的基因Cbei_4110，以提高丁醇产量。所述菌株可以是所有能够发酵产丁醇的拜氏梭菌，例如拜氏梭菌野生菌，或者经过诱变和基因工程改造后能出产生丁醇的拜氏梭菌，例如拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)IB4等。

其中，所述的拜氏梭菌优选为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NCIMB8052。

其中，所述的基因Cbei_4110，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

上述高产丁醇的基因工程菌的构建方法，它包括如下步骤：

(1)构建Cbei_4110基因的插入失活载体pWJ-392;

(2)将步骤(1)得到的载体pWJ-392转化入拜氏梭菌中，获得Cbei_4110基因插入失活的重组菌株。

具体可通过如下方法构建基因工程菌：在线设计内含子序列并基因合成，构建Cbei_4110基因缺失载体，并将构建好的重组载体转化拜氏梭菌，筛选出阳性重组菌。将含有重组载体的菌株划线挑选，菌落PCR筛出内含子插入的重组菌株，再将内含子插入的重组菌株在含有和不含有红霉素抗性平板上复筛，获得载体丢失、且Cbei_4110基因插入失活的目标重组菌株。

步骤(1)中，以含有二型内含子的大肠杆菌-拜氏梭菌穿梭载体pWJ为出发载体，构建Cbei_4110基因的插入失活载体pWJ-392。

步骤(2)中，将载体pWJ-392引入拜氏梭菌中，实现Cbei_4110基因的插入失活，采用电转化法。