[发明专利]一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光QRT-PCR引物、探针及其使用方法

权利要求书

1.一组检测牛、羊赤羽病病毒核酸的引物，其特征在于，所述引物为Pf99/AKAV和Pr184/AKAV，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。

2.一种检测牛、羊赤羽病病毒核酸的探针，其特征在于，所述探针为Pb132/AKAV，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；该探针的5’端标记有报告荧光染料，3’端标记有淬灭荧光染料。

3.根据权利要求2所述检测牛、羊赤羽病病毒核酸的探针，其特征在于，所述的报告荧光染料为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITC、CY3或CY5中的一种，所述的淬灭荧光染料为BHQ1、BHQ2、TAMRA、ROX或DABCY1中的一种。

4.根据权利要求2所述检测牛、羊赤羽病病毒核酸的探针，其特征在于，所述的报告荧光染料为FAM，所述的淬灭荧光染料为BHQ1。

5.一种检测牛、羊赤羽病病毒核苷酸的方法，其特征在于，该方法是以样品的核酸为模板，利用引物Pf99/AKAV和Pr184/AKAV、探针Pb132/AKAV进行一步法实时荧光QRT-PCR扩增；

所述扩增的结果判定方法为：扩增反应结束后，如果出现特异性荧光扩增曲线，则判定样品的核酸中含有牛、羊赤羽病病毒核酸，即该样品为牛、羊赤羽病病毒阳性。

6.根据权利要求5所述检测牛、羊赤羽病病毒核酸的方法，其特征在于，所述样品的核酸为RNA。

7.根据权利要求5所述检测牛、羊赤羽病病毒核酸的方法，其特征在于，所述一步法实时荧光QRT-PCR扩增的反应体系如下：

2×quant one step probe QRT-pcr master mix             25μL；

hotmaster taq polymerase（2.5U/μL）                       2.0μL；

quant rtase（for one step）                                           0.7μL；

引物Pf99/AKAV                                                        0.2μL；

引物Pr184/AKAV                                                       0.2μL；

探针Pb132/AKAV                                                       0.1μL；

模板                                                                          20.0μL；

ddH₂O                                                                       1.8μL。

8.根据权利要求5所述检测牛、羊赤羽病病毒核酸的方法，其特征在于，所述一步法实时荧光QRT-PCR扩增的反应条件如下：50℃逆转录30min；92℃变性3min；以92℃、10s，55℃、30s，68℃、60s预扩增4个循环；92℃、10s，60℃、40s主扩增40个循环，收集荧光信号。