[发明专利]一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光QRT-PCR引物、探针及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于病毒分子生物学检测技术领域。更具体地，涉及一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光QRT-PCR引物、探针及其使用方法。

背景技术

赤羽病（Akabane disease，AKAD）又名阿卡斑病，是由赤羽病病毒（Akabane virus，AKAV）引起的牛、绵羊和山羊的一种多型性病毒传染病。该病的病症主要有流产、早产、死胎、胎儿畸形、木乃伊等，能引起先天性关节弯曲和积水性无脑综合症。该病为虫媒性传染病，传播媒介为吸血的蚊、库蠓等。赤羽病是世界动物卫生组织（OIE）法定通报性疾病，也是我国从国外进口牛、羊必须检测的7种疫病之一。研究表明，该病在我国进口牛、羊的主要国家存在，因此有随着牛、羊进口引进该病的风险。如果该病随着大量牛、羊的进口传入我国，将给我国畜牧业造成严重的经济损失。

由于感染动物早期一般不出现临床症状，该病在8～9月份发生流产及早产，且数量激增，至10月份为最高峰，往往被误认为是由热应激引起，不易在感染早期发现。因此，及早发现牛、羊群是否感染赤羽病病毒，是减少生产损失的有效途径。由于感染早期动物体内的病毒复制有限，不易检测，因此感染早期的动物往往检测不出来。

为防治和消灭牛、羊赤羽病，首先必须迅速、准确地检测出赤羽病病毒。经过几十年的努力，赤羽病检测技术从最早的病毒分离鉴定到血清学试验，目前已发展为更敏感、更特异、更方便、更经济的分子生物学检测技术。张吉红等根据GenBank中赤羽病病毒的基因序列，设计了特异性引物和探针，建立了检测赤羽病病毒的Real-time RT-PCR方法，但是其敏感性并不是特别好，检测下限为1.18ng/μL，仍然满足不了对感染早期牛、羊群准确检测的要求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有检测牛、羊赤羽病病毒方法的敏感性不足等问题，提供一组准确、快速、特异性好、敏感性更强的检测牛、羊赤羽病病毒的引物、探针及其使用方法。

本发明的目的是提供一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光QRT-PCR引物和探针。

本发明另一目的是提供一种利用所述引物和探针检测牛、羊赤羽病病毒的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一组检测牛、羊赤羽病病毒核酸的引物，所述引物为Pf99/AKAV和Pr184/AKAV，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明还提供了一种检测牛、羊赤羽病病毒核酸的探针，所述探针为Pb132/AKAV，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；该探针的5’端标记有报告荧光染料，3’端标记有淬灭荧光染料。

优选地，所述的报告荧光染料为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITC、CY3或CY5中的一种，所述的淬灭荧光染料为BHQ1、BHQ2、TAMRA、ROX或DABCY1中的一种。

更优选地，所述的报告荧光染料为FAM，所述的淬灭荧光染料为BHQ1。

本发明所述引物和探针是根据Genebank上公布的赤羽病S基因保守片段序列，利用Primer Express 3.0基因分析软件设计。所有引物和探针的合成均由上海英骏生物技术有限公司完成。

本发明还提供了一种利用上述引物和探针检测牛、羊赤羽病病毒核酸的方法，该方法是以样品的核酸为模板，利用引物Pf99/AKAV和Pr184/AKAV，以及探针Pb132/AKAV进行一步法实时荧光QRT-PCR扩增；

所述扩增的结果判定方法为：反应结束后，如果出现特异性荧光扩增曲线则判定样品的核酸中含有牛、羊赤羽病病毒核酸，即该样品为牛、羊赤羽病病毒阳性。

优选地，所述样品的核酸为RNA。

优选地，所述实时荧光QRT-PCR扩增的反应体系如下：

2×quant one step probe QRT-pcr master mix             25μL；

hotmaster taq polymerase（2.5U/μL）                       2.0μL；

quant rtase（for one step）                                            0.7μL；

引物Pf99/AKAV                                                          0.2μL；