[发明专利]克隆表达优化的非洲猪瘟VP72基因引物序列、基因、核酸疫苗及构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及兽医生物技术和基因工程技术领域，特别是涉及一种克隆表达优化的非洲猪瘟VP72基因引物序列、基因、核酸疫苗及构建方法。

背景技术

非洲猪瘟是猪的一种烈性病毒病，自1909年首次在非洲发现以来，目前已蔓延扩散到整个非洲、欧洲和南美洲等国家和地区，发病国家因此蒙受了巨大的经济损失，该病被国际动物卫生组织（OIE）列为重要动物疫病。我国虽然还没有发现非洲猪瘟疫情，但根据周边国家的发病情况，以及2006年以来我国部分省市暴发的猪流行性疫病给我们敲响了警钟，我国已面临ASFV传入和流行的严重威胁。目前，国内外学者对其疫苗研制开展了大量工作，但还无有效的疫苗和药物可以预防和治疗该病。研究发现，非洲猪瘟灭活疫苗效果不明显，而弱毒疫苗的安全性差，易导致慢性流行，迫切需要一种新型疫苗来克服目前存在的问题。

核酸疫苗与传统的灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗等相比，其具有如下优点：1免疫保护力增强，主要是通过接种后蛋白质在宿主细胞内表达，直接与组织相容性复合物MHC I或II类分子结合，同时诱导产生细胞免疫和体液免疫；2制备简单，省时省力。核酸疫苗作为一种重组质粒，易在工程菌内大量扩增，提纯方法简单，且可将编码不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价核酸疫苗，这样可大大减少人力、物力、财力以及多次接种带来的应激反应；3同种异株交叉保护是核酸疫苗的最大优点之一，可通过对基因表达载体所携带的靶基因进行改造，从而选择抗原决定簇；4核酸疫苗应用较安全，接种后蛋白质抗原在宿主细胞内表达，不存在毒力返祖或残留毒力病毒引起发病的危险，也不会引起对机体的不良反应；5可产生持久免疫应答，一次接种可获得长期免疫力，无需反复多次加强免疫；6贮存、运输方便，核酸疫苗的质粒DNA稳定性好，便于贮存和运输，无须冷藏。因此，核酸疫苗可能是解决非洲猪瘟免疫防控的有力工具。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对当前国内外无非洲猪瘟有效疫苗防控的问题，提供一种克隆表达优化的非洲猪瘟VP72基因引物序列、基因、核酸疫苗及构建方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案是，提供一种克隆表达优化的非洲猪瘟VP72基因引物序列，其特征在于，该引物序列如序列表中的SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所述，其中SEQ ID No.1为非洲猪瘟病毒VP72基因上游引物，SEQ ID No.2为非洲猪瘟病毒VP72基因下游引物。

本发明还提供一种克隆表达优化的非洲猪瘟VP72基因，包括序列表中SEQ ID NO.3的基因序列。

本发明还提供一种非洲猪瘟核酸疫苗，该疫苗由序列表中SEQ ID NO.3的非洲猪瘟VP72基因和真核表达载体组成。

在本发明所述的非洲猪瘟核酸疫苗中，所述的真核表达载体可为任何一种DNA疫苗载体。

在本发明所述的非洲猪瘟核酸疫苗中，所述的真核表达载体为pcDNA3.3。

本发明还提供一种非洲猪瘟核酸疫苗的构建方法，包括如下步骤：

（1）合成ASFV VP72基因，并克隆至pUC18克隆载体中，标记为pUC18-ASFV VP72；

（2）根据已经合成的ASFV VP72基因核酸序列，利用核酸引物设计软件设计特异性PCR引物，并在上游引物引入G/A NN序列，引物序列分别如序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；并从pUC18-ASFV VP72质粒中扩增获得包括NN序列和ASFV VP72全基因的序列，大小为1944bp，如序列表中SEQ ID NO.3所示；

（3）将步骤（1）中扩增获得的ASFV VP72基因经过凝胶电泳、回收后，克隆到pcDNA3.3真核表达载体中，得到重组质粒pcDNA-ASFV-VP72；

（4）用Puv I限制性内切酶将高度纯化的pcDNA-ASFV-VP72线性化后，利用脂质体将其转染到BHK-21细胞中，经过G418持续加压筛选、PCR检测鉴定后，获得阳性细胞系。

根据本发明构建的非洲猪瘟核酸疫苗，使得非洲猪瘟VP72基因在哺乳动物细胞中显著表达，并有效刺激被接种动物的免疫系统，使之产生较好的体液免疫反应和细胞免疫反应，有利于免疫抵抗非洲猪瘟病毒。

附图说明

图1非洲猪瘟VP72基因的PCR扩增

图2重组质粒pcDNA-ASFV-VP72的PCR鉴定

其中1：阴性对照；2、3：VP72引物对扩增pcDNA-ASFV-VP72质粒的PCR结果；