[发明专利]一种关于黄嘌呤氧化酶抑制剂及自由基清除剂的高通量筛选方法

权利要求书

1.一种关于黄嘌呤氧化酶抑制剂及自由基清除剂的高通量筛选方法，其特征在于：以黄嘌呤氧化酶-NBT为反应体系，以96孔板为反应载体，以酶标仪为检测器，检测计算待测物在相应浓度下的黄嘌呤氧化酶抑制率/超氧阴离子清除率。

2.如权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

a)分别配制待测物溶液、混合底物反应液、黄嘌呤氧化酶液以及空白缓冲液；

b)在96孔板中设置对照孔、空白孔、检测孔和校准孔，在对照孔和空白孔中分别加入200μL由溶剂与混合底物反应液按体积比1:10～1:40形成的混合液，在检测孔和校准孔中分别加入200μL由待测物溶液与混合底物反应液按体积比1:10～1:40形成的混合液；再向对照孔和检测孔中加入20μL黄嘌呤氧化酶液，向空白孔和校准孔中加入20μL空白缓冲液，然后将96孔板放入酶标仪内，振摇96孔板使孔内的溶液混合均匀；开始计时，在25～44℃下反应15～30分钟；向上述每孔中加入反应终止剂使终止反应；在400～700nm的紫外光下对上述各孔进行OD值检测；

c)计算待测物在各浓度下的黄嘌呤氧化酶抑制率/超氧阴离子清除率：

I=[(OD_对照-OD_空白)-(OD_检测-OD_校准)]/(OD_对照-OD_空白)×100%；

其中：OD_对照为对照孔的OD值；OD_空白为空白孔的OD值；OD_检测为检测孔的OD值；OD_校准为校准孔的OD值。

3.如权利要求2所述的高通量筛选方法，其特征在于：所述的混合底物反应液包括黄嘌呤、氮蓝四唑（NBT）和pH为6.0～9.0的PBS，其中：黄嘌呤的摩尔浓度为0.100～0.166mmol/L、氮蓝四唑的摩尔浓度为0.200～0.334mmol/L、PBS的摩尔浓度为50mmol/L。

4.如权利要求2所述的高通量筛选方法，其特征在于：所述的黄嘌呤氧化酶液包括黄嘌呤氧化酶、EDTA和pH为6.0～9.0的PBS，其中：酶活力为20～120mU/mL，EDTA的摩尔浓度为0.5mmol/L，PBS的摩尔浓度为50mmol/L。

5.如权利要求2所述的高通量筛选方法，其特征在于：所述的空白缓冲液包括EDTA和pH为6.0～9.0的PBS，其中：EDTA的摩尔浓度为0.5mmol/L，PBS的摩尔浓度为50mmol/L。

6.如权利要求2所述的高通量筛选方法，其特征在于：所述的反应终止剂为摩尔浓度为0.1～0.4mol/L的盐酸水溶液。