[发明专利]一种关于黄嘌呤氧化酶抑制剂及自由基清除剂的高通量筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种关于黄嘌呤氧化酶抑制剂及自由基清除剂的高通量筛选方法，属于生化分析技术领域。

背景技术

黄嘌呤氧化酶是体内核酸代谢中重要的酶，广泛分布于人体心、肺、肝等组织细胞浆内。黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤和次黄嘌呤的氧化生成尿酸，并产生超氧阴离子。尿酸和超氧阴离子都是对人体有危害的物质，尿酸是痛风的一个重要生物指标，并且与心血管疾病、肾脏疾病等相关；而超氧阴离子则与癌变、衰老等相关，若不能及时清除，将会对机体造成损伤。目前广泛使用的黄嘌呤氧化酶抑制剂主要是别嘌呤醇、非布索坦，超氧阴离子清除剂则主要为BHT，BHA等化学合成类药物，在临床实践中出现很多不良反应和副作用。所以，有效、低毒、价廉的黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂的寻找是目前研究的一大热点。因而，建立一种方便、快捷、稳定、可靠的活性测定方法，就具有显著的必要性。

黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选一般采用经典试管法，这种方法反应体积较大，需要的待测物量相对也较大，并且一次只能检测一个样本。因此，现在也发展出了其他的筛选方法，如薄层生物自显影法，该方法能够快速对天然产物中的活性成分进行定位与测定，但是由于IC50无法测得，限制了其运用；也曾有报道用液相色谱法进行活性物质的筛选，虽然该方法能减少复杂样本中其它化合物的干扰，但运用此方法时，反应结束后将涉及样品处理等繁琐步骤，检测环节耗时也相对较长；虽然质谱方法能通过检测目标产物来间接测定活性，但操作的复杂及过程的耗时同样不适宜进行大量样本的筛选。而且，并不是所有执行活性检测的实验室都具备能进行液相色谱分析或质谱分析的硬件条件。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题和需求，本发明的目的是提供一种关于黄嘌呤氧化酶抑制剂及自由基清除剂的高通量筛选方法，以实现简单操作、高灵敏度及高通量筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂及自由基清除剂的目的。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种关于黄嘌呤氧化酶抑制剂及自由基清除剂的高通量筛选方法，是以黄嘌呤氧化酶-NBT为反应体系，以96孔板为反应载体，以酶标仪为检测器，检测计算待测物在相应浓度下的黄嘌呤氧化酶抑制率/超氧阴离子清除率。

作为一种优选方案，上述的高通量筛选方法包括如下具体步骤：

a)分别配制待测物溶液、混合底物反应液、黄嘌呤氧化酶液以及空白缓冲液；

b)在96孔板中设置对照孔、空白孔、检测孔和校准孔，在对照孔和空白孔中分别加入200μL由溶剂与混合底物反应液按体积比1:10～1:40形成的混合液，在检测孔和校准孔中分别加入200μL由待测物溶液与混合底物反应液按体积比1:10～1:40形成的混合液；再向对照孔和检测孔中加入20μL黄嘌呤氧化酶液，向空白孔和校准孔中加入20μL空白缓冲液，然后将96孔板放入酶标仪内，振摇96孔板使孔内的溶液混合均匀；开始计时，在25～44℃下反应15～30分钟；向上述每孔中加入反应终止剂使终止反应；在400～700nm的紫外光下对上述各孔进行OD值检测；

c)计算待测物在各浓度下的黄嘌呤氧化酶抑制率/超氧阴离子清除率：

I=[(OD_对照-OD_空白)-(OD_检测-OD_校准)]/(OD_对照-OD_空白)×100%；

其中：OD_对照为对照孔的OD值；OD_空白为空白孔的OD值；OD_检测为检测孔的OD值；OD_校准为校准孔的OD值。

作为进一步优选方案，所述的混合底物反应液包括黄嘌呤、氮蓝四唑（NBT）和pH为6.0～9.0的PBS，其中：黄嘌呤的摩尔浓度为0.100～0.166mmol/L、氮蓝四唑的摩尔浓度为0.200～0.334mmol/L、PBS的摩尔浓度为50mmol/L。

作为进一步优选方案，所述的黄嘌呤氧化酶液包括黄嘌呤氧化酶、EDTA和pH为6.0～9.0的PBS，其中：酶活力为20～120mU/mL，EDTA的摩尔浓度为0.5mmol/L，PBS的摩尔浓度为50mmol/L。

作为进一步优选方案，所述的空白缓冲液包括EDTA和pH为6.0～9.0的PBS，其中：EDTA的摩尔浓度为0.5mmol/L，PBS的摩尔浓度为50mmol/L。

作为进一步优选方案，所述的反应终止剂为摩尔浓度为0.1～0.4mol/L的盐酸水溶液。