[发明专利]一种黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶在毕赤酵母的表达方法及其应用

权利要求书

1.一种利用毕赤酵母表达黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于工艺步骤为：

(1)根据黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶基因的ORF核苷酸序列和表达载体pPICZαA的核苷酸序列设计引物；

(2)通过PCR技术获得带有限制性酶切位点和切除信号肽的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶基因的核苷酸序列；

(3)将上述获得的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶基因的核苷酸序列克隆到pMD18-T载体上，进行DNA序列测定，然后从pMD18-T载体上切下，克隆到表达载体pPICZαA上，建成表达重组质粒pPICZαA-LAAO；

(4)将构建重组质粒pPICZαA-LAAO，经过Sal I酶切线性化，电转化至Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，将菌液涂布到含有300μg/mLZeocin的YPDS平板上，28℃倒置培养2-3d，获得重组转化子；

(5)提取转化子基因组，通过特异PCR的方法鉴定获得已经正确插入目的基因的重组子；

(6)接种鉴定验证正确的重组转化子于25mL BMGY(pH6.0)培养基中，28℃，250r/min培养48h，至OD600为2-6，于室温离心2000r/min，5min，收集菌体；将菌体转移至200mL BMMY培养基中，28℃，250r/min培养，每隔24h补加一次为培养基体积0.5％的甲醇，诱导表达24-96h；

(7)所得上清液即为表达的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液。

2.根据权利要求1所述一种利用毕赤酵母表达黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于表达载体pPICZαA含有α-factor核苷酸序列，Zeocin抗性基因的核苷酸序列，AOX1TT基因的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述一种利用毕赤酵母表达黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于采用PCR技术制备黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的DNA序列的5’端带有Xho I限制性核酸内切酶对应酶切的核苷酸序列，α-factor信号肽对应的核苷酸序列和翻译起始密码子ATG核苷酸序列，3’端带有Not I限制性核酸内切酶对应酶切的核苷酸序列和6个组氨酸对应的核苷酸序列；将黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的DNA序列亚克隆到pMD18-T载体上，经过转化、提取质粒、酶切鉴定、DNA测序，将正确的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶DNA片段经Xho I和Not I限制性核酸内切酶消化，从pMD18-T载体上切下，同时将表达载体pPICZoA按同样的方式酶切，按一定方式拼接构建重组表达载体pPICZαA-LAAO。

4.根据权利要求1所述一种利用毕赤酵母表达黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于重组表达载体pPICZαA-LAAO转化进入毕赤酵母GS115受体菌中组成黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶重组蛋白表达工程菌，所得工程菌发酵培养。

5.根据权利要求1所述一种利用毕赤酵母表达黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于诱导表达时间为72h。

6.根据权利要求1所述一种利用毕赤酵母表达黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于诱导表达的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液经过80％饱和硫酸铵浓缩。

7.一种权利如要求1所述的一种利用毕赤酵母表达黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的方法制备的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液在制备抗无乳链球菌和温和气单胞杆菌的制剂中的应用。