[发明专利]一种黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶在毕赤酵母的表达方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及基因重组技术，指采用基因重组技术将黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的基因克隆到表达载体上，构建表达重组质粒，并转化入毕赤酵母，组建表达工程菌。经发酵、表达上清浓缩，获得由毕赤酵母表达的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液，该粗酶液对鱼类革兰氏阳性病原菌(无乳链球菌)和革兰氏阴性病原菌(温和气单胞杆菌)具有抑菌作用。

背景技术

在之前的研究中，我们从黄斑蓝子鱼血清中分离纯化了一种抗微生物活性蛋白，通过对该活性蛋白N端测序，质谱测序分析，设计兼并引物进行PCR，利用RACE技术最终获得了该活性蛋白基因全长序列，并确认该活性蛋白是一种黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶(发明专利号：ZL201010577872.6)。

L-氨基酸氧化酶(LAAO)是一种以FAD或FMN为辅基的黄素蛋白酶，在有氧条件下，能催化L-氨基酸的氧化脱氨反应，产生相应的α-酮酸、氨和H₂O₂。LAAO在生物体内(如细菌、真菌、藻类、动植物体)有广泛的分布并可参与L-氨基酸的代谢过程。该酶在细胞凋亡、细胞毒性、浮肿、溶血、出血、血小板凝集、杀寄生虫和抗微生物等方面都具有活性。该蛋白家族中的蛇毒L-氨基酸氧化酶(SV-LAAO)在蝰科、响尾蛇科及眼镜蛇科中具有广泛分布，并因其含量高、酶活性强、易于纯化，成为该类酶中研究最多的一类。

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和温和气单胞杆菌(Aeromonas sobria)分别为养殖鱼类常见并具有代表性的革兰氏阳性病原菌和革兰氏阴性病原菌。近年来，由于我国水产养殖的超负荷发展，养殖环境的恶化，鱼类细菌病已经成为大范围、经常性爆发的一类疾病，给我国渔业造成了非常严重的危害，抗生素和违禁药品的大量使用，这给食品安全造成严重威胁，因此开发新型药物迫在眉睫。

发明内容

本发明提供一种黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶在毕赤酵母的表达方法，具体如下(见实施例一)和通过该方法诱导表达的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液的应用(见实施例二)。

本发明是以黄斑蓝子鱼脾脏总cDNA为模板，通过PCR技术获得带有限制性酶切位点(Xho I、Not I)，α-factor信号肽核苷酸序列，翻译起始密码子ATG以及切除信号肽的黄斑蓝子鱼LAAO基因的核苷酸序列，将该黄斑蓝子鱼LAAO基因的核苷酸序列克隆到pMD18-T载体上，进行DNA序列测定，然后从pMD18-T载体上切下，克隆到表达载体pPICZαA上，建成表达重组质粒pPICZαA-LAAO，将此构建的黄斑蓝子鱼LAAO重组质粒转入宿主菌毕赤酵母GS115内，组成工程菌，通过诱导工程菌发酵、发酵液浓缩，获得诱导表达的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液(见实施例一)。

本发明提供的方法制备的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液，通过实验证明，对鱼类革兰氏阳性病原菌(无乳链球菌)和革兰氏阴性病原菌(温和气单胞杆菌)具有抑菌作用(见实施例二)。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明：

图1.黄斑蓝子鱼LAAO基因DNA片段制备的PCR扩增引物。

A：正向引物；B：反向引物。

图2.PCR检测酵母工程菌基因组插入LAAO基因电泳图(1：酵母工程菌基因组提取电泳图；2：LAAO基因特异引物PCR结果电泳图)。

M：DNA maker；1，3：转入pPICZαA载体的毕赤酵母工程菌；2，4：转入

pPICZαA-LAAO载体的毕赤酵母工程菌。

图3.表达产物Western Blotting检测(1：SDS-PAGE电泳图；2：Western blotting杂交分析)。

M：蛋白Maker；1：毕赤酵母菌株诱导表达上清浓缩产物；2：转入pPICZαA

载体的毕赤酵母工程菌诱导表达上清浓缩产物；3：转入pPICZαA-LAAO载体的毕赤酵母工程菌诱导表达上清浓缩产物。

图4.黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶毕赤酵母表达粗酶液的琼脂孔穴平板扩散抑菌结果(1：温和气单胞杆菌；2：无乳链球菌)。

A：转入pPICZαA载体的毕赤酵母工程菌诱导表达上清浓缩产物；B：转入pPICZαA-LAAO载体的毕赤酵母工程菌诱导表达上清浓缩产物；C：氟苯尼考；D：PBS。

具体实施方式

实施例一：黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶在毕赤酵母的表达方法