[发明专利]牛体外受精胚胎培养液和培养方法

说明书

技术领域

本发明属于农业-畜牧兽医领域，具体地说，涉及一种牛体外受精胚胎培养液和培养方法。

背景技术

随着现代农业科技的发展，为了更充分利用良种母牛的繁殖潜力，加速遗传育种进程，在生产实践中应用高效的繁殖新技术成为必然。活体采卵（Ovum pick UP，OPU）和体外受精技术（In Vitro Fertilization，IVF）是二十世纪八十年代快速发展起来的胚胎工程新技术，二者相结合可获得大量遗传系谱明确的胚胎，从而缩短世代间隔。目前，这两种技术已经成为欧美和大洋洲等畜牧业发达国家的农场主为扩大良种母牛群而采用的重要繁殖技术。然而，采用常规的牛胚胎培养体系（CR1aa和SOF液），牛体外受精的囊胚发育率较低，而且胚胎质量也远不及体内胚胎，导致胚胎移植受体后的妊娠率低，因此如何提高囊胚发育率及胚胎质量成为体外受精胚胎生产的重点和研究的焦点。

早在1878年，德国人Scnenk就以家兔和豚鼠为材料，开始探索哺乳动物的体外受精技术。但直到1951年，美籍华人张民觉和Austin分别发现精子体外获能现象后，体外受精技术才获得了突破性进展。牛体外受精技术受到卵母细胞的体外成熟、精子的体外获能、受精卵的体外培养环境等多个方面的影响。

胚胎的体外培养是IVF技术的一个关键环节，亦是卵母细胞体外成熟和体外受精技术最终效果的体现和检验。在体外受精后，受精卵在向囊胚发育过程中将需经历一系列重要的变化，包括合子的形成、第一次卵裂、胚胎基因组的激活、致密化以及形成囊胚。这一过程中，外界环境的变化会导致基因表达发生改变，从而影响胚胎的正常发育及质量。目前，哺乳动物早期胚胎的体外培养研究主要集中在改善培养液成分以满足不同发育阶段的胚胎营养需求。基于Rosenkrans等（1991年）开发的Charles Rosenkrans1（CR1）培养液和Tervit等（1972年）开发的合成输卵管液（SyntheticOviductal Fluid，SOF），经多年不断改进逐步形成了两种培养体系。据Hakan Sagirkaya等（2007年）和Somfai等（2010年）研究成果表明，CR1aa培养液用于牛胚胎培养有较好的效果，可以广泛应用于牛的胚胎培养；Thompson,J.G.等（2000年）和Jean M.Feugang等（2009年）的研究结果显示，SOF培养液也是一种适合于牛胚胎培养的培养体系。张志平等（2006年）和桑国俊等（2008年）研究结果也显示，经过优化的CR1aa和SOF培养液均适合于牛的体外胚胎培养，均取得良好的培养效果。哺乳动物早期胚胎发育是一个高度协调且精确调节的过程。在进化过程中，配子细胞逐步形成了一系列的分子级联网络，以保证胚胎发育周期系统地进行。在发育过程中，胚胎的内外活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）与抗氧化剂的平衡对早期胚胎发育起着决定性作用。

大多生化反应均产生ROS，其在细胞内、外均有着重要的作用，一部分ROS起着信号分子的作用，但是大多数ROS对机体是有害的。Brooker,R.J.等（2011年）报道，ROS可以引起细胞DNA损伤、不饱和脂肪酸的氧化、蛋白质中氨基酸的氧化甚至可以导致某些酶的失活。一般来说，ROS以四种形式存在，其中H₂O₂氧化作用较强，是引起氧化伤害的最主要因素。

大量研究表明，谷胱甘肽（GSH）是以非蛋白质形式存在的一种抗氧化剂，能够清除多种自由基：超氧阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢、次氯酸和脂氧自由基，并且能够维持细胞内外氧化还原平衡。细胞内外环境GSH和ROS水平是影响受精卵发育过程中的两个重要因素。早在2000年，de Matos等曾通过在体外胚胎培养过程中添加β-巯基乙醇、半胱氨酸和胱氨酸来提高囊胚率。

尽管体外受精技术能成功应用于许多哺乳动物，但由于体外受精的囊胚率低而导致体外受精胚胎的生产成本高、效率低，限制了该技术在牛快速扩繁实践中的广泛应用。因此，如何能够降低成本并提高牛IVF胚胎生产效率和胚胎质量成为亟待解决的问题。