[发明专利]一种多基因共转化毕赤酵母的新方法

权利要求书

1.一种多基因共转化毕赤酵母的新方法，其特征在于，利用该方法可以实现2个及以上基因共转化毕赤酵母（以共转2个基因为例），主要包括以下步骤：

 PCR分别扩增多个需要在转化到毕赤酵母中的目标基因（命名为A基因、B基因、C基因、D基因……，等等），分别构建目标基因的酵母表达载体（以酵母分泌表达载体pPICZα为例）pPICZα-A、pPICZα-B、pPICZα-C pPICZα-D……，等等；本发明以共表达两个基因（A基因和B基因，本发明中A、B基因分别以常用的绿色荧光蛋白基因eGFP和红色荧光蛋白基因Cherry为代表）为例进行说明；Bgl II-BamH I双酶切表达载体pPICZα-A，得到A基因酵母的独立表达框“Box-A”；BamH I单酶切pPICZα-B，将“Box-A”和酶切后的pPICZα-B进行连接，得到同时含有A基因及B基因的酵母表达载体载体pPICZαA/B；以此类推，若要实现A、B、C三个基因的表达，可将pPICZαA/B BamH I单酶切与利用Bgl II-BamH I双酶切表达载体pPICZα-C所得独立表达框“Box-C”进行连接，得到可独立表达的共表达载体pPICZαA/B/C，以此类推，可以构建更多基因独立表达的多基因共表达载体（本发明以共表达两个基因A、B为例进行说明）；酵母共表达载体载体pPICZαA/B电转化毕赤酵母，涂布YPDZ抗性平板，转化子长出后，利用A基因及B基因的引物PCR法对转化子进行验证，检测A和B基因插入到酵母基因组中的情况，挑选出既能扩增出A基因又能扩增出Ｂ基因的转化子即为共表达A、B基因的酵母转化子。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的共表达宿主菌为毕赤酵母，表达载体为毕赤酵母表达载体。

3.根据权利要求1所述的应用，外源基因为任意两种（或两种以上）需要在酵母中独立且共表达的外源基因。