[发明专利]一种多基因共转化毕赤酵母的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多基因共转化毕赤酵母的新方法，具体来说涉及两个及以上基因共转化酵母并获得多基因整合到同一毕赤酵母基因组中的方法，该酵母转化子中各外源基因在相同且又彼此独立的基因表达调控元件控制下具有独立表达的能力。

背景技术

甲醇酵母表达系统是目前应用非常广泛的酵母表达系统。以Pichia pastoris（P. pastoris，毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还具有以下几个优点：①具有特有强力醇氧化酶基因AOX1启动子，用甲醇可以严格调控外源蛋白的表达；②作为真核表达系统，表达的蛋白可以进行翻译后加工和修饰；③易于利用发酵罐进行高密度连续培养，大量表达目的产物；④营养要求低，生长快，可以在廉价的非选择性培养基中生长；⑤表达量高，许多蛋白可达到克/升及以上水平；⑥在P. pastoris中表达的蛋白既可存在于胞内又可分泌至胞外；⑦糖基化程度低。利用启动子AOX1，已在毕赤酵母中高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段和基因工程抗体等多种外源基因。该系统是一种以提高表达量并保持生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，非常适宜扩大为工业规模。该系统表达的Cephelon制剂等早已获得FDA批准，所以该系统被认为是安全的。

到目前为止，虽然有数千个外源基因实现了在毕赤酵母中的表达，但这些都是单一的外源基因在毕赤酵母中表达。为实现两上或以上基因在同一毕赤酵母中表达，目前主要方法有：（1）将多个需要表达的外源基因融合再转化酵母进行表达；（2）将外源基因串联于一个读码框架内，利用IRES实现两个基因的各自表达；（3）分别构建外源基因的表达载体，先将其中的一个转化毕赤酵母，得到酵母转化子，然后将另一个基因再次转化已转入一个基因的酵母中，以实现两个基因同时整合到酵母基因组中。然而，以上3种方法都存在明显的不足：首先，将不同的通过PCR连接，进行融合再构建表达载体。这种方法所得到的转化子的表达产物只能是两个基因融合的产物，并且将基因进行融合表达的毕赤酵母转化子的分泌表达量很低，其低水平分泌表达的主要原因之一可能是两亚基的基因片段融合所得到的融合基因片段明显变大，这可能影响到基因的转录、翻译及蛋白质的分泌；其次，将两个亚基串联于一个读码框架内，利用IRES实现两个或多个基因的各自翻译，从而获得目标蛋白。但是，利用该方法得到的产物的表达量往往非常低。其原因主要在于，两个或多个基因串联于同一个读码框内，再加上IRES序列，基因片段比融合表达的基因片段更大，在仅有共同的表达调控元件调空下，尤其是在唯一的启动子控制下，会影响基因的转录和翻译，从而很难获得高水平分泌表达的毕赤酵母转化子；最后，分别构建外源基因的表达载体，先将其中的一个转化毕赤酵母，得到酵母转化子，然后将另一个基因再次转化已转入一个基因的酵母中，以实现两个基因同时整合到酵母基因组中的方法往往较难筛选到两个基因同时插入的酵母转化子，因为当转化第二种基因时，第一个基因很可能被从染色体中重组而去除掉；若要得到3个及个以上基因共表达的酵母转化子概率更低，很难筛选到所有基因都整合的酵母转化子。因此，建立一种快速、简便的多基因共转化毕赤酵母的方法将有助于实现多个基因在酵母中共表达，为重组蛋白尤其是包含两个以上不同亚基的外源蛋白在毕赤酵母中共表达提供一种新的方法。

发明内容

基于此，本发明提供一种多基因共转化毕赤酵母的新方法，利用本方法，可以实现将需要表达的多个外源基因克隆到同一毕赤酵母表达载体中，在该表达载体中，每个基因都位于彼此独立的表达框内；同时，用构建的该表达载体电转化毕赤酵母，其生长出的酵母转化子经PCR分析，可以得到同时含有全部多个基因的酵母转化子，实现多个基因同时整合到酵母基因组中，每个基因都在相同且独立的表达调控元件控制下，可以实现独立且共同表达。该方法为实现多个基因同时在酵母中彼此独立表达提供了一种新的有效方法。

解决上述问题的技术方案如下（以共转2个基因为例）：

1）PCR分别扩增2个目标基因（命名为A基因和B基因，本发明中A、B基因分别以常用的绿色荧光蛋白基因eGFP和红色荧光蛋白基因Cherry为代表），分别构建目标基因的酵母表达载体（以酵母分泌表达载体pPICZα为例）pPICZα-A和pPICZα-B；