[发明专利]高效液相色谱检测多肽尿素中聚天冬氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效液相色谱检测多肽尿素中聚天冬氨酸的方法。

背景技术

多肽尿素是近些年在市场上出现的新型肥料，又称为磁力多肽尿素。其本质是在传统的尿素中添加了聚天冬氨酸（或称聚天门冬氨酸），通过一些其他的加工工艺制成的新型肥料。聚天冬氨酸是一种人工仿生合成的水溶性高分子物质，具有无磷、无毒、无公害和可完全生物降解的特性，是一种国际公认的“绿色化学品”。聚天冬氨酸因含有肽键和羧基等活性基团的结构特点，具有极强的螯合、分散、吸附等作用，且配伍性极佳。聚天冬氨酸在土壤中可以延长尿素释放时间，有利于土壤中微生物的生长，不会给作物和土壤带来污染和副作用，它可以对作物内源生长素进行全面调控，明显提高尿素利用效率，增加作物的抗逆性，大幅度提高作物产量与品质。

多肽尿素中聚天冬氨酸含量的多少直接影响产品的质量和应用性能，因此分析聚天冬氨酸含量十分重要，目前还未见多肽尿素中聚天冬氨酸含量高效液相色谱分析方法的报道。

发明内容

本发明目的在于，提供一种多肽尿素中聚天冬氨酸的高效液相色谱分析方法，该方法采用反相高效液相色谱法，测定多肽尿素中聚天冬氨酸含量，为多肽尿素聚天冬氨酸含量的控制提供了可靠的检测数据。本发明能够通过简单的方法检测多肽尿素中聚天冬氨酸的含量，检测结果准确、稳定。

本发明所述的一种高效液相色谱检测多肽尿素中聚天冬氨酸的方法，按下列步骤进行：

a、色谱柱的选择：选用规格为5um，250×4.6mm，C18柱；

b、流动相的选择：选用流动相为体积比甲醇∶水=6:94，加入体积百分比三乙胺0.04%，用体积比稀磷酸1∶10调节流动相pH9.5；

c、检测波长的选择：用LabTech754系列紫外线可见分光光度计在209nm处进行紫外吸收扫描；

d、标准溶液配置及外标法标准工作曲线的确定：称取0.4075g聚天冬氨酸标准品用步骤b流动相定溶于50ml容量瓶中，作为母液，随后配制系列浓度为0.0033mg/ml、0.0065mg/ml、0.0163mg/ml、0.0408mg/ml、0.0815mg/ml和0.1630mg/ml的聚天冬氨酸标准品溶液，每个点做三个平行试验，做外标曲线；

e、样品的测定方法：称取4.0055g多肽尿素样品，用步骤b流动相定容于50ml容量瓶中，然后吸取2.5ml溶液定容于25ml容量瓶中，采用步骤a选择的C18色谱柱，用步骤b选择的流动相，以流动相流速0.7ml/min在液相色谱上测试6次即可。

步骤b中的水为双蒸水。

本发明所述的一种高效液相色谱检测多肽尿素中聚天冬氨酸的方法，该方法在色谱条件的选择中，常规的C18色谱柱在高水流动相条件下长时间操作，常会出现“柱塌陷”现象，导致分离目标物的保留时间和分离度变化较大，分离不理想。而聚天冬氨酸本身是微碱性物质，所以应该选用能耐受高水流动相、能耐受碱性流动相的色谱柱进行分离，选用150mm长的色谱柱，目标物的分离度不理想，经过实验测试，最终选用DIKMA Spursil C18柱规格为5um250×4.6mm(ID)，能得到良好的分离效果；

在流动相的选择中，先后考察了几种不同组合的流动相，甲醇/水组合流动相，因为样品在高甲醇流动相中溶解度不是很好，并且在高甲醇流动相中，分离效果很差，大部分后面出峰的物质提前，分离度太差。选用高水的流动相，目标物分离效果比较好，又因为聚天冬氨酸本身是微碱性物质，最后选用流动相为比例：甲醇∶水=6:94（水为双蒸水），加入0.04%(体积分数)三乙胺，用稀磷酸（1∶10）调节流动相pH9.5，能对目标物很好的分离，重现性良好；

在检测波长的选择中，用LabTech754系列紫外线可见分光光度计在190nm-230nm处进行紫外吸收扫描，聚天冬氨酸在209nm处有最强吸收，尿素在200nm处有最强吸收，主要是检测尿素中的聚天冬氨酸，最终选择209nm为液相色谱的吸收波长。

本发明所述的一种高效液相色谱检测多肽尿素中聚天冬氨酸的方法，其特点为：采用C18反相色谱柱，以液相色谱方法准确测定多肽尿素中尿素含量的同时，可以准确测定的聚天冬氨酸含量，为多肽尿素中尿素和聚天冬氨酸含量的控制提供了可靠的检测数据。

附图说明

图1为本发明聚天冬氨酸含量外标法标准工作曲线图，其中回归方程：Y=19084683.43X-8807.45,相关系数：0.99997；