[发明专利]一种双重病毒灭活制备狂犬人免疫球蛋白的方法

权利要求书

1.一种双重病毒灭活制备狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征是制备工艺包括以下步骤：

（1）将原料血浆消毒后0.3倍稀释，用pH4缓冲液调pH为7.15~7.25，控制血浆温度1.5~2.5℃后喷入95%乙醇，乙醇的终浓度按照体积计为8%，喷入速度小于等于50L/h，再次调pH至7.2，并搅拌2小时后离心分离出组分Ⅰ，离心转速为8000~10000r/min，离心后得到的组分Ⅰ上清液；

（2）上述步骤得到的组分Ⅰ上清液调pH为6.85~6.95，加95%乙醇，乙醇的终浓度按照体积记为20%，喷入速度小于等于50L/h，再次调pH为6.85~6.95，并搅拌两小时后静置2小时，加入硅藻土，加入量为每1000ml反应液加入20kg硅藻土，并搅拌20分钟，压力分离出组分Ⅱ和组分Ⅲ的沉淀；

（3）上述步骤得到的组分Ⅱ和组分Ⅲ沉淀以氯化钠溶液溶解，调pH为5.05~5.15，调温度为-0.5~0℃，加入95%乙醇至乙醇终浓度按照照体积记为17%，而后搅拌2小时，静置6~12小时，得到充分混合液，将组分混合液压滤得到组分混合液上清；

（4）上述步骤得到的组分混合液上清液加入辛酸和PEG4000，搅拌2小时，离心，收集上清液；

（5）得到的上清液脱盐脱醇后超滤浓缩，得到组分混合液缩液；

（6）上述步骤得到的组分混合液缩液以凝胶柱进行层析提纯，得到层析蛋白液；

（7）上述步骤得到的层析蛋白液进行透析后，再超滤浓缩，得到层析蛋白浓缩液；

（8）上述步骤得到的层析蛋白浓缩液中加入麦芽糖，调pH 3.8~4.0后加水至最终蛋白质量百分含量为5.05%~5.2%，经0.2um除菌滤芯过滤得到免疫球蛋白一级制品；

（9）上述步骤得到的免疫球蛋白二级制品再次以水进行透析并超滤浓缩得到免疫球蛋白二级制品浓缩液；

（10）上述步骤得到的免疫球蛋白二级制品浓缩液按每升10~30g加入甘氨酸，并调pH 4.4~4.8，得到免疫球蛋白三级制品；

（11）上述步骤得到的免疫球蛋白三级制品在无菌条件下用35~50nm孔径膜进行纳米膜过滤，得到滤过液；

（12）上述步骤得到的滤过液调节pH 6.4~7.4，分装，得到狂犬人免疫球蛋白。

2.如权利要求1所述的一种双重病毒灭活制备狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于上述步骤（3）中，氯化钠溶液的使用量为每千克组分Ⅱ和组分Ⅲ的沉淀以9L 0.01mol/L氯化钠溶液溶解，调pH所用溶液是pH为4的醋酸溶液。

3.如权利要求1所述的一种双重病毒灭活制备狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤（4）中辛酸的加入量为10~20mmol，PEG4000的加入量为1%~2%，离心转速为8000~10000r/min。

4.如权利要求1所述的一种双重病毒灭活制备狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤（5）中脱盐脱醇超滤浓缩的具体方法为，用5倍体积的2~8℃的注射用水透析。

5.如权利要求1所述的一种双重病毒灭活制备狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤（6）中所用凝胶柱为DEAE-Sepharose-FF凝胶柱。

6.如权利要求1所述的一种双重病毒灭活制备狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤（11）中，纳米膜除病毒的的具体条件为：制品pH为4.4~4.8，甘氨酸含量为10~30g/L，蛋白浓度为110~150g/L，过滤温度为18~20℃，过滤量为230L/1.63 m²，过滤速度小于等于5L/min，纳米膜完整性测定，滤膜前后起泡点压力为≥4.5bar/cm²。