[发明专利]一种双重病毒灭活制备狂犬人免疫球蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种双重病毒灭活制备狂犬人免疫球蛋白的方法，属于生物制药领域。

背景技术

狂犬人免疫球蛋白属于血液制品，随着在临床上的广泛应用，如何保证血液制品的安全性、预防和控制经血液途径传播的疾病，已成为世界医药卫生界乃至整个社会普遍关注的焦点。目前，常用的血液制品灭活法多采用S/D处理和低pH孵化法。然而，S/D处理对非酯包膜病毒无效，还会引起部分蛋白质的变性；低pH孵化法对大多数非脂包膜病毒灭活能力有限。上述方法均不能满足目前对血液制品日益提高的安全标准和质量标准。目前也有利用辛酸钠除病毒的报道，当加入的辛酸钠浓度较高时，对灭活病毒有非常好的效果，但是过高的辛酸钠浓度会导致部分免疫球蛋白的变性以及多聚体的产生，对产品质量带来很大的影响。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种可降低病毒活性并且保证蛋白高活性、安全可靠的双重病毒灭活制备狂犬人免疫球蛋白的方法。

 一种双重病毒灭活制备狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征是制备工艺包括以下步骤：

（1）将原料血浆消毒后0.3倍稀释，用pH4缓冲液调pH为7.15~7.25，控制血浆温度1.5~2.5℃后喷入95%乙醇，乙醇的终浓度按照体积计为8%，喷入速度小于等于50L/h，再次调pH至7.2，并搅拌2小时后离心分离出组分Ⅰ，离心转速为8000~10000r/min，离心后得到的组分Ⅰ上清液；

（2）上述步骤得到的组分Ⅰ上清液调pH为6.85~6.95，加95%乙醇，乙醇的终浓度按照体积记为20%，喷入速度小于等于50L/h，再次调pH为6.85~6.95，并搅拌两小时后静置2小时，加入硅藻土，加入量为每1000ml反应液加入20kg硅藻土，并搅拌20分钟，压力分离出组分Ⅱ和组分Ⅲ的沉淀；

（3）上述步骤得到的组分Ⅱ和组分Ⅲ沉淀以氯化钠溶液溶解，调pH为5.05~5.15，调温度为-0.5~0℃，加入95%乙醇至乙醇终浓度按照照体积记为17%，而后搅拌2小时，静置6~12小时，得到充分混合液，将组分混合液压滤得到组分混合液上清；

（4）上述步骤得到的组分混合液上清液加入辛酸和PEG4000，搅拌2小时，离心，收集上清液；

（5）上述步骤得到的上清液脱盐脱醇后超滤浓缩，得到组分混合浓缩液；

（6）上述步骤得到的组分混合浓缩液以凝胶柱进行层析提纯，得到层析蛋白液；

（7）上述步骤得到的层析蛋白液进行透析后，再超滤浓缩，得到层析蛋白浓缩液；

（8）上述步骤得到的层析蛋白浓缩液中加入麦芽糖，调pH 3.8~4.0后加水至最终蛋白质量百分含量为5.05%~5.2%，经0.2um除菌滤芯过滤得到免疫球蛋白一级制品；

（9）上述步骤得到的免疫球蛋白二级制品再次以水进行透析并超滤浓缩得到免疫球蛋白二级制品浓缩液；

（10）上述步骤得到的免疫球蛋白二级制品浓缩液按每升10~30g加入甘氨酸，并调pH 4.4~4.8，得到免疫球蛋白三级制品；

（11）上述步骤得到的免疫球蛋白三级制品在无菌条件下用35~50nm孔径膜进行纳米膜过滤，得到滤过液；

（12）上述步骤得到的滤过液调节pH 6.4~7.4，分装，得到狂犬人免疫球蛋白。

所述的一种双重病毒灭活制备狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于上述步骤（3）中，氯化钠溶液的使用量为每千克组分Ⅱ和组分Ⅲ的沉淀以9L 0.01mol/L氯化钠溶液溶解，调pH所用溶液是pH 4的醋酸溶液。

 所述的一种双重病毒灭活制备狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤（4）中辛酸的加入量为10~20mmol，PEG4000的加入量为1%~2%，离心转速为8000~10000r/min。

 所述的一种双重病毒灭活制备狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤（5）中脱盐脱醇超滤浓缩的具体方法为，用5倍体积的2~8℃的注射用水透析。

 所述的一种双重病毒灭活制备狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤（6）中所用凝胶柱为DEAE-Sepharose-FF凝胶柱。