[发明专利]一种酿酒酵母基因工程菌株以及此菌株的构建方法和生产圣草酚或五羟黄酮的方法

权利要求书

1.一种酿酒酵母基因工程菌株，所述菌株携带有CZyF3’5’H基因，该基因序列如序列表1所示。

2.一种构建权利要求1所述重组类黄酮-3’，5’-羟基化酶基因工程菌株的方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)根据目的基因的DNA序列设计引物，以含有目的基因的质粒为模板进行PCR方法扩增，得到目的基因，其中目的基因序列如序列表1所示；

(2)将目的基因与pENTR^TM/TEV/D-TOPO质粒连接，得到连接反应物；

(3)将连接反应物转化宿主菌E.coli DH5α感受态细胞，涂布LB平板，挑选阳性克隆，将测序正确的菌株进行培养，提取质粒；

(4)将提取的质粒进行LR交换，将目的基因连接到pYES-dest52质粒上，得到连接反应物；

(5)将连接反应物转化宿主菌E.coli DH5α感受态细胞，涂布LB平板，挑选阳性克隆，并在LB培养基中培养然后提取质粒，得到带有目的基因的LR交换后的质粒。

(6)将步骤(5)获得的质粒转入到宿主菌细胞，涂布Ura缺陷型SD平板，挑选阳性菌落，即获得带有目的基因的基因工程菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中质粒为带有CZyF3’5’H基因的pENTR^TM/TEV/D-TOPO质粒或pENTR^TM/TEV/D-TOPO质粒的衍生物。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(3)中宿主为卡那霉素菌；步骤(5)中宿主为氨苄青霉素菌；步骤(6)中宿主为酿酒酵母菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(5)中质粒为带有CZyF3’5’H基因的pYES-dest52质粒或pYES-dest52质粒的衍生物。

6.一种利用权利要求1的酿酒酵母基因工程菌株生产圣草酚及五羟黄酮的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将酿酒酵母基因工程菌株接入到Ura缺陷型SD培养基培养得到活化的基因工程菌液；

(2)收集步骤(1)活化的菌体，接入到Ura缺陷型SD诱导培养基中培养得到诱导的基因工程菌株的菌液；

(3)将底物柚皮素加入到步骤(2)中诱导后的菌液中培养得到含有产物圣草酚及五羟黄酮的菌液。