[发明专利]一种酿酒酵母基因工程菌株以及此菌株的构建方法和生产圣草酚或五羟黄酮的方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用一种携带有能够表达类黄酮-3’，5’-羟基化酶的重组基因的酿酒酵母基因工程菌株以及利用此菌株高效生产环多羟基类黄酮的方法，属于生物工程技术领域。 

背景技术

5，7，3’，4’，5’-五羟黄酮，又名槲黄素或洋蔥素，是已知的几百种生物类黄酮中抗氧化效果最强的，其抗氧化力是维生素E的50倍，是维生素C的20倍，并且其分子结构小，水溶性好，容易被人体吸收。并且能够保护血管内壁免受到破坏，及对于心脏及血管健康有很大的帮助。 

圣草酚(Eriodictyo1)，又名北美圣草酚、毛纲草酚，为黄酮类物质。与五羟黄酮类似也具有较强的抗氧化性，同时具有较强的抗辐射、降血脂、降血糖功效，常用作饮料食品和酒类的抗氧化剂。并且是植物生长调节剂、功能性食品、化妆品和未来药物原料。 

针对苯丙烷代谢途径上游产物，市场上已有成熟的代谢菌株可高效生产柚皮素(Naringenin)产物，现Sigma官网市场报价为484元人民币每1g(纯度为98％)。而圣草酚现在的Sigma官网市场报价为907元人民币每1mg(纯度为99％)，价格较高，而五羟黄酮现在在市场上几乎没有销售。 

目前，提取五羟黄酮、圣草酚的方法主要是从柠檬或花生壳(姚丽，花生壳中5，7一二羟基色原酮及圣草酚的HPLC测定，食品科学；杜方岭，同时检测花生壳中5，7-二羟基色原酮、圣草酚和木犀草素的方法等)中进行天然提取，这些方法成本较高、易造成有机试剂和重金属污染，并且无法获得高纯度的茶多酚，难以获得较高纯度和理想的产率。 

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种酿酒酵母基因工程菌株，该菌株携带有类黄酮-3’，5’-羟基化酶的表达基因，能够用于高效表达CZyF3’5’H，从而可以用来生产圣草酚和五羟黄酮。 

为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的： 

一种酿酒酵母基因工程菌株，该菌株的生物学特征为携带有CZyF3’5’H 基因，该基因序列如序列表1所示。 

上述菌株是通过下述方法构建的： 

(1)根据目的基因的DNA序列设计引物，以含有目的基因的质粒为模板进行PCR方法扩增，得到目的基因，DNA序列如序列表1所示； 

(2)将目的基因与pENTR^TM/TEV/D-TOPO质粒连接得到连接反应物； 

(3)将连接反应物转化宿主菌E.coli DH5α感受态细胞，涂布LB平板(kan+)，挑选阳性克隆，将测序正确的菌株进行培养，提取质粒； 

(4)将提取的质粒进行LR交换，将目的基因连接到pYES-dest52质粒上得到连接反应物； 

(5)将连接反应物转化宿主菌E.coli DH5α感受态细胞，涂布LB平板(Amp+)，挑选阳性克隆并在LB培养基中培养，提取质粒，得到带有目的基因的LR交换后的质粒。 

(6)将步骤(5)获得的质粒转入到宿主菌细胞，涂布Ura缺陷型SD平板，挑选阳性菌落，即获得带有目的基因的基因工程菌。 

在上述构建方法中，CZyF3’5’H基因是由以上游引物VvF3’5’H-pENTR-F和下游引物CZF3’5’H-R为扩增引物，以VvF3’5’H基因的质粒为模板进行PCR扩增得到重组CZF3’5’H基因DNA，然后与yF3’5’H基因的DNA为共同模板，以上游引物VvF3’5’H-pENTR-F和下游引物yF3’5’H-R为扩增引物进行重叠PCR扩增得到CZyF3’5’H基因DNA。 

在上述构建方法中，步骤(1)中PCR产物的纯化回收可以采用PCR产物回收试剂盒或其它分子克隆中常用的纯化方法。 

在上述构建方法中，步骤(2)质粒还可以为带有CZyF3’5’H基因的pENTR^TM/TEV/D-TOPO质粒或pENTR^TM/TEV/D-TOPO质粒的衍生物。 

在上述构建方法中，步骤(3)中质粒的纯化提取可以采用分子生物实验手册中记载的任意高纯度质粒提取试剂盒的提取方法。 

在上述构建方法中，步骤(5)宿主为氨苄青霉素菌，步骤(6)宿主为酿酒酵母菌株WAT11。 

在上述构建方法中，步骤(5)质粒还可以为带有CZyF3’5’H基因的pYES-dest52质粒或pYES-dest52质粒的衍生物。