[发明专利]利用GST表达体系制备AQP7胞外段抗体及应用在审
申请号: | 201410079643.X | 申请日: | 2014-03-06 |
公开(公告)号: | CN104892758A | 公开(公告)日: | 2015-09-09 |
发明(设计)人: | 李晓萌;赵兵;杨百全;徐洪香;李江 | 申请(专利权)人: | 东北师范大学 |
主分类号: | C07K16/18 | 分类号: | C07K16/18;C07K16/06;C07K19/00;C12N15/70 |
代理公司: | 暂无信息 | 代理人: | 暂无信息 |
地址: | 130024 吉林省长*** | 国省代码: | 吉林;22 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 利用 gst 表达 体系 制备 aqp7 胞外段 抗体 应用 | ||
1.利用GST表达体系制备的AQP7蛋白胞外段高效价抗体,其特征在于利用GST表达体系以(AQP7蛋白218-255位氨基酸对应对应DNA片段作为特异序列制备的GST-AQP7融合蛋白作为抗原免疫动物产生抗血清而获得,该抗血清中抗GST-AQP7抗体的滴度高达1∶1000000,并经过Westernblot鉴定该AQP7抗体具有较好的特异性,其中,218-255位氨基酸序列为:
其对应核苷酸序列为:
。
2.如权利要求1所述的原核表达GST-AQP7融合蛋白的多克隆抗体的制备方法,其特征在于利用GST表达系统获得GST-AQP7融合蛋白,再经免疫兔获得抗GST-AQP7抗血清,具体包括五步:
第一步,PCR-PMD18-T/AQP7重组质粒的构建,AQP7基因全长从Genebank得到,基因序列号为BAC05693,以基因组为模板,上游引物为5’-GAATTCGGCATGAACACAGGATAT(含EcoRI酶切位点);下游:5’-CTCGAGCCACCACCAGTTCTCCCC(含XhoI酶切位点),扩增得到的片段与PMD18-T载体连接,将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中,在含Amp+琼脂平板上挑选克隆,以碱裂解法小提重组质粒后,以EcoRI和SalI分别单酶切鉴定;
第二步,原核表达载体pGEX-4T-1的构建,将含有AQP7基因218-255位氨基酸片段的pMD18-T质粒经EcoRI和XholI双酶切后,利用回收试剂盒获得AQP7基因该区片段,同时用相同的酶处理质粒pGEX-4T-1,然后将回收的AQP7基因胞外段218-255氨基酸片段和经酶切的载体pGEX-4T-1在T4DNA连接酶作用下于16℃连接过夜,酶切鉴定重组体,并且测序进一步确定;
第三步,GST-AQP7融合蛋白的诱导表达和纯化,重组质粒PGEX-4T-1/AQP7转化大肠杆菌BL21,挑取单菌落接入LB/Ampr/培养基中,37℃振摇培养过夜,次日,将培养物按1∶50的比例转接于含Amp+的LB培养基中,继续在37℃摇床培养至对数生长中期,在培养液的A600为0.5~0.6时,加入IPTG至终浓度0.08mmol/L,不加入IPTG者为阴性对照,置25℃继续培养4~5h,离心收集菌体,以SDS-PAGE进行 鉴定GST-AQP7融合蛋白的表达,并优化表达条件,进行大量扩增诱导,以5000r/min于4℃离心5min,收集菌体,用60mL冰预冷的NETN悬浮1L菌液的沉淀,用超声裂解细菌,再以9600rpm,于4℃离心15min,取上清,过Glutathione-Sepharose4B柱,先以等体积洗脱缓冲液1,含20mM谷胱甘肽、50mMTriscl,pH=8.0,洗脱,收集洗脱液,再以等体积洗脱缓冲液2,含100mM谷胱甘肽,洗两遍,收集洗脱液,SDS-PAGE鉴定纯化产物;
第四步,兔抗AQP7抗血清的制备及纯化
以纯化的AQP7融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔,初次免疫用500μg融合蛋白,与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射,免疫前取耳静脉血分离血清,作为免疫前的血清对照,2wk后进行第1次加强免疫,500μg纯化的AQP7融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀,前后四脚掌肌肉注射,之后每隔2wk加强免疫1次,于末次免疫后1wk/取耳血,用ELISA法测定抗体的效价,当抗体效价达到1∶1000000时,颈动脉放血,收集血清,将ProteinA/GsepharoseCL-4B填料缓慢装柱,平衡柱子后加入经过稀释的抗血清,控制流速保证抗血清与填料的结合,即亲和层析使抗体结合在柱子上,经2次洗涤后,加pH2.7洗脱缓冲溶液将抗体洗脱,收集洗脱液并测定各收集管的280nm光密度,将含抗体的收集管混合,纯化后的抗体与纯化前的抗血清用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定;
第五步,AQP7抗体的免疫学检测
用GST-AQP7融合蛋白免疫前的新西兰大白兔血清作为对照,将纯化后的GST-AQP7抗体先稀释10倍再倍比稀释后,采用间接ELISA方法测定抗体的效价,并采用Westernblot方法分析AQP7抗体特异性,将纯化的融合蛋白GST-AQP7样品,经SDS-PAGE分离后再电转移至硝酸纤维素膜上,以5%脱脂奶粉封闭1h,依次滴加兔抗AQP7抗体,室温2h、PBS洗3次,山羊抗兔IgG2HRP,室温反应1h、PBS洗涤3次,最后加底物DAB显色,并拍照。
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