[发明专利]利用GST表达体系制备AQP7胞外段抗体及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域,具体涉及利用GST原核表达体系制备GST-AQP7融合蛋白的多克隆抗体及应用。 

背景技术

AQP7蛋白（定义为人类9号染色体上）有选择性的表达于睾丸精子细胞、肾近端小管直部、树突状细胞及骨骼肌细胞中。功能性研究证明AQP7能够通透水、甘油和尿素。 

随着研究的深入我们对于AQP7蛋白功能及作用机制产生了更多的思考，如它在睾丸生精过程中的作用机制，它在是否精子成熟过程有促进作用等等。而研究一种新的蛋白质的功能,抗体是最有力的工具之一，在蛋白质的检测和功能研究中广泛应用的免疫组织化学、免疫印迹和免疫沉淀等一系列技术，都是基于抗原-抗体相互作用发展起来的。因此我们制备的AQP7蛋白高效价抗体对于系统研究AQP7蛋白作用机制意义重大。 

发明内容

本发明的目的是建立一种能够用于AQP7蛋白的检测的模型，为从蛋白水平深入研究AQP7蛋白功能及相关疾病提供必要的实验工具。 

利用基因工程技术，将AQP7蛋白胞外段218-255位氨基酸对应DNA片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后,用重组质粒转化大肠杆菌BL21，并经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-AQP7融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清，并应用ProteinA/G将其纯化，获得多克隆抗体。抗体的效价及特异性采用ELISA和Westernblot检测。 

本发明的GST-AQP7融合蛋白是将利用特殊序列(AQP7蛋白胞外段218-255位氨基酸对应DNA片段)构建GST-AQP7融合蛋白原核表达载体,转化BL21得到的高效表达特异性的GST-AQP7融合蛋白，这段218-255位氨基酸序列为： 

这种GST-AQP7融合蛋白及其多克隆抗体制备包括以下步骤： 

第一步，克隆载体的构建 

从人AQP7基因全长上应用PCR技术以基因组为模板,扩增得到的目的片段与PMD18-T载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后,酶切鉴定并测序。 

第二步，原核表达载体pGEX-4T-1的构建 

将克隆质粒和质粒pGEX-4T-1双酶切后,利用回收试剂盒获得AQP7基因该区片段和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组的表达载体。酶切鉴定重组体,并且测序进一步确定。 

第三步，GST-AQP7融合蛋白的诱导表达和纯化 

重组质粒PGEX-4T-1/AQP7转化大肠杆菌BL21,利用IPTG诱导,GST-AQP7融合蛋白的表达。以SDS-PAGE进行鉴定,，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。用超声裂解细菌，所获蛋白用Glutathione-Sepharose4B柱纯化,SDS-PAGE鉴定纯化产物。 

第四步，兔抗AQP7抗血清的制备及纯化 

以纯化的AQP7融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔,初次免疫用500μg融合蛋白,与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离血清,作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫,500μg纯化的GST-AQP7融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀,前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。于末次免疫后1wk取耳血,用ELISA法测定抗体的效价,当抗体效价达到1∶100000时,颈动脉放血,收集血清。用ProteinA/G纯化抗AQP7血清，准备蛋白AsepharoseCL-4B亲和柱，亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，将抗体洗脱，达到纯化目的，SDS-PAGE鉴定纯化产物，获得该发明的多克隆抗体。应用多种免疫学方法检测其效价及特异性，结果显示该抗体可特异性的与AQP7蛋白结合。 

利用AQP7蛋白胞外段218-255位氨基酸基因序列成功地构建GST-AQP7融合蛋白原核表达载体,转化BL21后可高效表达特异性的GST-AQP7融合蛋白。以该融合蛋白免疫兔子获得抗GST-AQP7融合蛋白的高效价抗体经多种免疫学方法检测抗体效价及特异性，结果表明抗体效价高达1:1000000且特异性良好。抗体可应用于精子中AQP7蛋白的检测，对于系统研究AQP7蛋白在精子发生、精子成熟等过程中的作用机制意义重大。另外，AQP7蛋白为精子表面特异性蛋白，我们制备的AQP7抗体为精子分离研究提供了条件。 

附图说明：