[发明专利]转基因水稻科丰2号外源基因纯合/杂合状态的PCR检测引物、检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因植物外源基因插入的纯合/杂合状态的检测方法，尤其涉及转基因水稻科丰2号外源基因插入的纯合/杂合状态的检测方法，属于转基因水稻外源基因插入的纯合/杂合状态的检测领域。

背景技术

标准物质是食品、农产品中转基因成分检测的“金标准”，是依法开展转基因生物安全监管的重要物质基础。转基因成分检测标准物质研制对原材料的均匀性、稳定性、特征量值范围等方面有严格要求。目前，国内外转基因成分检测普遍采用基于核酸的定性、定量检测方法。其中定量检测通常采用RealTime-PCR方法对样品中靶标核酸序列进行绝对定量，即测定外源DNA插入特征序列的拷贝数，并以此为基础计算样品中转基因成分的含量。在转基因成分检测中，可以将外源DNA看作一个基因座位，一个纯合体的2倍体基因组中检测靶标核酸序列，即外源DNA插入特征序列的拷贝数为2，一个杂合体的2倍体基因组中外源DNA插入特征序列的拷贝数为1，非转基因材料中则为0。因而，转基因检测标准物质制备原材料的均匀性、稳定性、特征量值范围主要体现在外源DNA插入所产生的特征序列的杂合或纯合状态。在标准物质的研制过程中，必需对原材料中靶标核酸序列的遗传特性进行确认，即确认外源DNA插入所产生的特征序列是纯合还是杂合状态。

此外，在转基因作物遗传育种过程中，往往需要将转基因材料与其它材料进行杂交、转育以获得适合的栽培品种，利用分子生物学手段快速、简便鉴定纯合体/杂合体育种材料，也有利于缩短育种进程。

目前，已报道的转基因成分检测方法，主要包括针对外源目的基因、调控元件的筛选检测和基因特异性检测，针对遗传转化载体构建特征的构建特异性检测，针对外源DNA插入特征序列的品系特异性检测等三类。利用以上方法，只能确定样品中是否含有转基因成分或含有何种转基因成分，但无法直接鉴别样品中外源DNA插入的纯合或杂合状态。迄今未止，国内外目前还没有针对转基因水稻科丰2号外源基因纯合/杂合状态的检测方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供检测转基因水稻科丰2号外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测引物；

本发明的目的之二是提供转基因水稻科丰2号外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测方法；

本发明的目的之三是提供转基因水稻科丰2号外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先提供了用于检测转基因水稻科丰2号外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测引物，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

根据转基因水稻科丰2号品系中插入的目的基因为SCK基因，本发明通过Hi-TAIL PCR获得外源插入SCK基因的5’端水稻侧翼序列和3’端水稻侧翼序列，所获得的含有SCK基因的外源插入载体及其两侧5’端和3’端侧翼水稻序列的连接区的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；本发明进一步根据科丰2号外源插入载体和3’端水稻侧翼序列所形成的连接区核苷酸序列设计出一套能够准确检测转基因抗虫水稻科丰2号外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测引物，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

本发明的目的之二是提供一种转基因抗虫水稻科丰2号外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测方法，该方法包括：（1）提取待检测水稻样品的DNA；（2）以提取的DNA为模板，以SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列为扩增引物，建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；（3）如果仅扩增出一条401bp片段，为纯合转基因水稻科丰2号；如果扩增出401bp和541bp的两条片段，为杂合转基因水稻科丰2号；如果只扩增出一条541bp片段，为非转基因水稻。

其中，所述的从待检测水稻样品中提取DNA的方法，可以是从植物材料中提取DNA的各种常用方法，例如可以是CTAB法、异硫氰酸胍法或盐酸胍法等各种方法。