[发明专利]高穿透性纳米抗体融合蛋白制备及其在抗肿瘤中的应用

权利要求书

1.高穿透性纳米抗体融合蛋白，其特征在于：该蛋白由靶向人EGFR纳米抗体和肿瘤穿透肽iRGD经由连接肽linker，即GGGGSGGGGSGGGGS连接组成。

2.高穿透性纳米抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：通过设计三条引物在已保存有ant i-EGFR基因片段的载体pSJF2上进行聚合酶链式反应扩增得到HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD基因片段，并克隆到表达载体pET-28a上，构建表达载体pET-28a-ant i-EGFR-iRGD，并经过测序验证，将其转化入大肠杆菌BL21DE3表达菌，经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导融合蛋白表达，通过镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白，可得到聚丙烯酰氨凝胶电泳纯95％，15mg/L细菌培养物的融合蛋白；

上游引物P1：

5’-CATGCCATGGGCCATCACCATCACCATCACCAGGTAAAGCTGGAG-3’

45bp

下游引物P2：

5’-CGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGTTCAGATCTTCTTCGCTGATC-3’

67bp

下游引物P3：

5’-CCCAAGCTTCTAGCAGTCCGGACCTTTGTCACCACGGCACGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC-3’

84bp

(1)重组人ant i-EGFR-iRGD基因片段扩增：

选用上游引物P1和下游引物P2，以已保存有ant i-EGFR基因片段的pSJF2载体重组质粒为模板，聚合酶链式反应扩增出Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker，将此作为模板，再用上游引物P1和下游引物P3进行聚合酶链式反应，得到Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD-Hind III；

(2)ant i-EGFR-iRGD表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGD的构建：

将步骤(1)中获得的ant i-EGFR-iRGD目的基因聚合酶链式反应产物纯化回收，并将其与载体pET28a连接，构建ant i-EGFR-iRGD表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGD，通过转化入大肠杆菌DH5α，进行抗性筛选挑选连接成功的菌株，并用菌液聚合酶链式反应手段对表达载体进行鉴定，挑选得到阳性克隆按照质粒小提试剂盒使用说明提取质粒并送测序验证；

(3)将表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGD转化至表达菌株BL21DE3：

取已经确认的100μg/μL表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGD0.1μL-5μL转化入氯化钙制备的表达菌株BL21DE3感受态细胞中，涂布到特定抗性的LB平板上，挑选阳性克隆低温冰箱内甘油保存该菌种；

(4)重组ant i-EGFR-iRGD的诱导表达及纯化：

1)重组ant i-EGFR-iRGD异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达：

对重组ant i-EGFR-iRGD用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，在诱导4小时后，聚丙烯酰氨凝胶全蛋白电泳；

2)重组ant i-EGFR-iRGD经AKTA Purifier900FPLC系统，镍离子亲和层析柱纯化：

收集1000mL经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后的BL21DE3菌体，用PBS、5mM咪唑重悬菌体，350W功率进行超声破碎，12000r·min-1离心后收集上清液于AKTA Purifier900FPLC系统纯化，最后通过对纯化的蛋白进行聚丙烯酰氨凝胶电泳，检测蛋白，测定纯度；

(5)AXIMA MALDI-LNR-TOF验证纯化蛋白的分子量为18KD。

3.高穿透性纳米抗体融合蛋白作为抗肿瘤药物的应用，其特征在于高穿透性纳米抗体融合蛋白为活性成分用于治疗肿瘤。

4.根据权利要求3所述的高穿透性纳米抗体融合蛋白作为抗肿瘤药物的应用，其特征在于所述肿瘤特别是指胃癌和胃转移癌。

5.根据权利要求3所述的高穿透性纳米抗体融合蛋白作为抗肿瘤药物的应用，其特征在于含有作为活性成分的高穿透性纳米抗体融合蛋白的液体制剂，适于经直肠、鼻内、肺部、阴道内、外部、口服或肠胃外，包括皮下、植入、静脉内和肌内给药。