[发明专利]高穿透性纳米抗体融合蛋白制备及其在抗肿瘤中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物与新医药技术领域，特别涉及高穿透性纳米抗体融合蛋白制备及其在抗肿瘤中的应用。

背景技术

在本发明作出之前，肿瘤的靶向治疗研究是迄今提高肿瘤治疗效果、减少药物毒副反应的最有效、最有实际应用潜力的措施之一。融合蛋白(重组蛋白)的构建和表达为肿瘤靶向药物的研发提供了方法。然而这类药物只对一小部分(通常＜20％)肿瘤发挥作用，通过个体化地检查药物疗效相关生物标志，才能确定少数适宜用药的患者，并且药物发挥理想抗肿瘤效应的前提不仅仅是设法让药物积聚于肿瘤局部，更重要的是要使药物在肿瘤局部获得良好的穿透性，使其更多地进入肿瘤细胞而发挥作用。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述缺陷，研究高穿透性纳米抗体融合蛋白制备及其在抗肿瘤中的应用。

本发明的技术方案如下：

高穿透性纳米抗体融合蛋白，其主要技术特征在于：该蛋白由靶向人EGFR纳米抗体和肿瘤穿透肽iRGD经由连接肽linker，即GGGGSGGGGSGGGGS连接组成。

本发明的另一技术方案是：

高穿透性纳米抗体融合蛋白的制备方法，其主要技术特征在于它包括以下步骤：通过设计三条引物在已保存有ant i-EGFR基因片段的载体pSJF2上进行聚合酶链式反应扩增得到HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD基因片段，并克隆到表达载体pET-28a上，构建表达载体pET-28a-ant i-EGFR-iRGD，并经过测序验证，将其转化入大肠杆菌BL21DE3表达菌，经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白表达，通过镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白，可得到聚丙烯酰氨凝胶电泳纯95％，15mg/L细菌培养物的融合蛋白；

上游引物P1：

5’-CATGCCATGGGCCATCACCATCACCATCACCAGGTAAAGCTGGAG-3’

45bp

下游引物P2：

5’-CGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGTTCAGATCTTCTTCGCTGATC-3’

67bp

下游引物P3：

5’-CCCAAGCTTCTAGCAGTCCGGACCTTTGTCACCACGGCACGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC-3’

84bp

(1)重组人ant i-EGFR-iRGD基因片段扩增：

选用上游引物P1和下游引物P2，以已保存有ant i-EGFR基因片段的pSJF2载体重组质粒为模板，聚合酶链式反应(PCR)扩增出Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker，将此作为模板，再用上游引物P1和下游引物P3进行PCR反应，得到Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD-Hind III；

(2)ant i-EGFR-iRGD表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGD的构建：

将步骤(1)中获得的ant i-EGFR-iRGD目的基因PCR产物纯化回收，并将其与载体pET28a连接，构建ant i-EGFR-iRGD表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGD，通过转化入大肠杆菌DH5α，进行抗性筛选挑选连接成功的菌株，并用菌液PCR手段对表达载体进行鉴定，挑选得到阳性克隆按照质粒小提试剂盒使用说明提取质粒并送测序验证；

(3)将表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGD转化至表达菌株BL21DE3：

取已经确认的100μg/μL表达载体pET28a-ant i-EGFR-iRGD0.1μL-5μL转化入氯化钙制备的表达菌株BL21DE3感受态细胞中，涂布到特定抗性的LB平板上，挑选阳性克隆低温冰箱内甘油保存该菌种；

(4)重组ant i-EGFR-iRGD的诱导表达及纯化：

3)重组ant i-EGFR-iRGD异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达：

对重组ant i-EGFR-iRGD用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，在诱导4小时后，聚丙烯酰氨凝胶全蛋白电泳；

4)重组ant i-EGFR-iRGD经AKTA Purifier900FPLC系统，镍离子亲和层析柱纯化：