[发明专利]一种同时检测人的冠状病毒229E、OC43、NL63的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术应用领域，尤其是用于人的冠状病毒229E、OC43、NL63的同时检测与鉴定。

背景技术

人冠状病毒(Human coronaviruses)属于冠状病毒科，是病毒中的一个大家族，因电镜下病毒颗粒形似王冠而得名。冠状病毒颗粒形态呈圆形、椭圆形或轻度多形性，直径100nm～120nm，其基因组为单股正链RNA，是目前已知的RNA病毒中最大的(大小介于27kb～32kb之间)，基因组含有约7～10个功能基因，其中4～5个编码结构蛋白，从5’端至3’端依次为5’-多聚酶-HE-S-E-M-N-3’。冠状病毒具有严格的宿主特异性，只感染自然宿主或亲缘关系密切的宿主，冠状病毒感染广泛分布于全世界各地，主要发生在冬春季节。人冠状病毒HCoV-229E和HCoV-OC43是在1960年发现的，SARS-CoV是在2003年流行的，HCoV-NL63和HCov-HKU1分别在2004、2005年被确定，目前，在人群中常发的是HCoV-229E、HCoV-OC43及HCoV-NL63，是人群呼吸道感染的重要病原体成员之一。

目前，国内外检测冠状病毒的经典方法是病毒的分离培养，但是其操作烦琐，耗费时间长；电镜、免疫组化、EL1SA、常规PCR等具有各自突出的优点，但都很难检测微量核酸和准确定量，20世纪末发展起来的实时荧光定量PCR技术(Real-time fluorescent quantitative PCR)是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，该技术不仅实现了对模板的定性和定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实验多重反应、自动化程度高、无污染性、具有实时性和准确性等特点。因而，在呼吸道病原体检测中具有巨大应用优势。相对普通PCR及单荧光PCR，多重荧光PCR具有以下优点：(1)检测效率高，即多重荧光PCR可以实现一管多检，通过收集的不同波长的荧光信号来区分不同的检测对象，从而简化操作流程；(2)节省试剂成本和人员操作时间，尤其在开展大量样品检测时，可以显著地降低检测成本和操作时间。(3)本方法中含内质控基因的监控，在各类标本中，存在各种影响或抑制PCR反应的因素，且在标本的采集处理、核酸提取、扩增和分析过程中，也可能因人为操作失误而导致产生假阴性检测结果。因此本申请采用内质控的方法，在标本中含有的内质控基因(LDHA)经历检测标本核酸提取、加样、PCR扩增及信号检测的全过程，从而可对每一份标本实施监控。

本发明成功建立的可同时检测人的冠状病毒229E、OC43、NL63一步法多重荧光RT-PCR方法，也采用LDHA作为内质控，可以有效监控样本中的PCR抑制因素以及由操作误差所造成的假阴性结果。并且该方法除了具有特异性强、灵敏度高、检测效率高及稳定性的特点之外，其检测所需要RNA量较少，且操作简便快速，在病毒的现场检测、卫生评价、临床诊断等方面显示出良好的应用前景。并有利于进一步深入研究相关病原体感染的分子机理和免疫调节机理、开展有效的临床治疗等方面显示出良好的应用前景。

发明内容

本发明是由国家“十二五”科技重大专项2012ZX10004206-002支持的。我们成功设计和合成了针对人的冠状病毒229E、OC43、NL63相应N基因特异性引物和探针。基于此引物和探针，我们建立了一步法含内质控的多重荧光RT-PCR检测方法。该方法通过对多种呼吸道病毒的检测、标准曲线的构建、与商品化单重荧光RT-PCR诊断试剂盒比较、重复性试验等，说明该方法具有较高的特异性、灵敏度、高效性和稳定性。

在本发明的第一方面，提供了一种针对人的冠状病毒229E、OC43、NL63相应N基因的特异性引物和探针序列，如SEQ NO：1至12所示。

在本发明的第二方面，提供一种同时检测人的冠状病毒229E、OC43、NL63的的试剂盒，该试剂盒中含有第一方面所述引物和探针。

在一个实施方案中，所述试剂盒包括以下成份：

a)反应缓冲液，所述缓冲液为常规PCR反应缓冲液；

b)反应酶，所述反应酶为常规PCR反应酶；

c)SEQ NO：1、2、4、5、7、8、10、11所示的引物；

d)SEQ NO：3、6、9、12所示的探针

e)无RNA酶的水。