[发明专利]检测血液中弓形虫感染的双重荧光定量PCR方法及其特异引物

权利要求书

1.两种检测弓形虫感染的特异引物对，其特征在于：

利用 ITS-1序列设计第一种特异引物对，所述第一种特异引物对为：

上游：5′-ACAGCGAAGGGGCTCAAT-3′；

下游：5′-AGCAATCTGAAAGCACATCG-3′；

利用529bp序列设计第二种特异引物对，所述第二种特异引物对为：

上游：5′-AGCCACAGAAGGGACAGAAGT-3′；

下游：5′-GTCTCTTTTTCCACCCTCCAG-3′。

2.采用权利要求 1所述的两种特异引物对检测血液中弓形虫感染的双重荧光定量PCR方法，其特征在于：所述双重荧光定量PCR方法包括以下步骤：

1）提取弓形虫RH株的基因组模板；

2）利用两种特异引物对分别进行Touch-down PCR扩增；

3）分别回收步骤2）扩增的目的片段，将其连接到PUM-T载体并转化到大肠杆菌中；在36-38℃、100-200rpm/min条件下将大肠杆菌摇培过夜，用质粒回收试剂盒提取经过夜培养的大肠杆菌菌液，即得到两种重组质粒，分别对两种重组质粒进行基因测序，得到重组质粒PUM-T-ITS-1和PUM-T-529bp ；

4）标准曲线的建立，将步骤3）获得的PUM-T-ITS-1和PUM-T-529bp重组质粒作为标准品，经紫外分光光度计测定两种标准品的OD₂₆₀值，经以下公式计算得到标准品的拷贝数：

质粒拷贝数=质粒浓度×阿氏常数/质粒的分子量

5）标准曲线的绘制，将获得的两种标准品分别稀释成不同梯度浓度，作为模板进行荧光定量PCR反应，反应完成后，得出每个拷贝数所对应的CT值，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，测得的每个拷贝数所对应的CT值为纵坐标，以PUM-T-ITS-1和PUM-T-529bp作为标准品分别作标准曲线；

6）溶解曲线的绘制，取步骤1）提取的RH株弓形虫DNA作为模板，分别对两种特异引物对进行双重荧光定量PCR反应；对反应后产物采用ABI 7500 software v2.0.5进行分析。

3.根据权利要求2所述的检测血液中弓形虫感染的双重荧光定量PCR方法，其特征在于：所述步骤6）的双重荧光定量PCR反应，其反应条件为：95℃， 30S；95℃ ，5S；60℃，30S；40个循环。

4.根据权利要求2所述的检测血液中弓形虫感染的双重荧光定量PCR方法，其特征在于：所述步骤6）的双重荧光定量PCR反应，

其反应体系为：SYBR Premix Dimer Eraser(2×) 10μL，荧光定量PCR上下游引物混匀后各取0.3μL（0.2μL -0.5μL），ROXⅡ0.4μL，补充灭菌水至反应总体系为20μL。

5.根据权利要求2所述的检测血液中弓形虫感染的双重荧光定量PCR方法，其特征在于：所述步骤6）溶解曲线的绘制时，双重荧光定量PCR反应条件为：95℃，15S； 60℃，1min； 95℃，30S。