[发明专利]检测血液中弓形虫感染的双重荧光定量PCR方法及其特异引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用荧光定量PCR技术检测病原的方法，具体涉及检测血液中弓形虫的双重荧光定量PCR检测方法及其特异引物。

背景技术

弓形虫是一种人畜共患的原虫，其主要在人畜孕期感染，能通过胎盘或产道引起宫内感染，导致流产、死胎或胎儿生长迟缓、先天畸形、新生儿期感染及婴、幼儿生长发育障碍。我国每年约有26,000个弓形虫病毒感染患儿出生，平均每小时就有3个，弓形虫已经严重威胁到人畜的健康，弓形虫不仅可以在水生和陆生动物中可以检测出还能够在蔬菜中检测出弓形虫，因此建立一种可靠，敏感的检测方法势在必行。

荧光定量PCR，即SYBRGreeⅠreal-timePCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其具有高特异性，高灵敏性，低污染和实时监测的特点，在检测病原的方面有一种不可替代的优势。

发明内容

本发明的目的在于提供检测血液中弓形虫的双重荧光定量PCR检测方法及其特异引物。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：

两种检测弓形虫感染的特异引物对，

利用ITS-1序列设计第一种特异引物对，所述第一种特异引物对为：

上游：5′-ACAGCGAAGGGGCTCAAT-3′；

下游：5′-AGCAATCTGAAAGCACATCG-3′；

利用529bp序列设计第二种特异引物对，所述第二种特异引物对为：

上游：5′-AGCCACAGAAGGGACAGAAGT-3′；

下游：5′-GTCTCTTTTTCCACCCTCCAG-3′。

529bp序列和ITS-1序列为弓形虫基因组中高度保守的序列，适宜用来设计特异引物对。

采用权利要求1所述的两种特异引物对检测血液中弓形虫感染的双重荧光定量PCR方法，所述双重荧光定量PCR方法包括以下步骤：

1）提取弓形虫RH株的基因组模板；

2）利用两种特异引物对分别进行Touch-down PCR扩增；

3）分别回收步骤2）扩增的目的片段，将其连接到PUM-T载体并转化到大肠杆菌中；在36-38℃、100-200rpm/min条件下将大肠杆菌摇培过夜，用质粒回收试剂盒提取经过夜培养的大肠杆菌菌液，即得到两种重组质粒，分别对两种重组质粒进行基因测序，得到重组质粒PUM-T-ITS-1和PUM-T-529bp；

4）标准曲线的建立，将步骤3）获得的PUM-T-ITS-1和PUM-T-529bp重组质粒作为标准品，经紫外分光光度计测定两种标准品的OD260值，经以下公式计算得到标准品的拷贝数：

质粒拷贝数=质粒浓度×阿氏常数/质粒的分子量

5）标准曲线的绘制，将获得的两种标准品分别稀释成不同梯度浓度，作为模板进行荧光定量PCR反应，反应完成后，得出每个拷贝数所对应的CT值，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，测得的每个拷贝数所对应的CT值为纵坐标，以PUM-T-ITS-1和PUM-T-529bp作为标准品分别作标准曲线；

6）溶解曲线的绘制，取步骤1）提取的RH株弓形虫DNA作为模板，分别对两种特异引物对进行双重荧光定量PCR反应；对反应后产物采用ABI7500software v2.0.5进行分析。

所述步骤6）的双重荧光定量PCR反应，其反应条件为：95℃，30S；95℃，5S；60℃，30S；40个循环。

所述步骤6）的双重荧光定量PCR反应，

其反应体系为：SYBR Premix Dimer Eraser(2×)10μL，荧光定量PCR上下游引物混匀后各取0.3μL（0.2μL-0.5μL），ROXⅡ0.4μL，补充灭菌水至反应总体系为20μL。

所述步骤6）溶解曲线的绘制时，双重荧光定量PCR反应条件为：95℃，15S；60℃，1min；95℃，30S。

本发明所用药品均购于试剂公司。

本发明后文中出现的双重SYBRGreenⅠreal-time PCR反应，即双重荧光定量PCR反应。

本发明设计real-time PCR的特异引物对所用软件为Primer5.0。