[发明专利]转录因子结合位点调节启动子强度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及转录因子结合位点调节启动子强度的方法，属于生物化工领域。 

背景技术

随着代谢工程的发展以及合成生物学的兴起，无论是在宿主微生物中移植外源代谢途径还是延长宿主微生物的分支代谢途径，都涉及到多酶催化反应，大部分的研究主要集中于选择合适的酶来催化反应，这主要是因为酶是代谢工程中的首要决定因素，并且酶的来源十分广泛，而且在不同的宿主中表达可能会产生不同的催化特性。但是，选择合适的启动子对于代谢工程同样十分重要，这不仅是由于基因的转录水平是由启动子决定的，而且启动子易于控制调节基因的转录。 

启动子的选择在代谢工程的设计中是十分重要的组成部分。在大肠杆菌中，通过利用强启动子对其进行代谢途径的改造，成功的在大肠杆菌中生产出1,4-丁二醇、1-丁醇、异丁醇和聚乳酸。在链霉菌中，利用不同的启动子激活其细胞内沉默的基因簇成功的合成出新的抗生素。在酿酒酵母细胞中，利用强组成型启动子过量表达磷酸戊糖途径的相关酶类，使酿酒酵母具有代谢木糖的能力。另外，通过多基因启动子穿梭技术提高了酿酒酵母利用木糖生产乙醇的效率，在引入大肠杆菌的阿拉伯糖降解途径后，使其也可以利用阿拉伯糖进行代谢发酵生产乙醇。半乳糖诱导型启动子在代谢工程中的应用也十分广泛，其中应用最为成功的是利用其在酿酒酵母中高效生产青蒿酸。 

在代谢工程的实际应用中发现，启动子并不是越强越好，平衡的代谢流才最有利于目标产物的合成，因此不同强度的启动子就显得十分必要，在现有的启动子基础上对其进行改造可以满足这种需求，而主要的改造的方法有以下几种。1）Ep-PCR，Ep-PCR可以在DNA序列中随机的引入突变，在整个启动子的序列内引入随机突变可以建立数目相当的突变启动子文库，在合适的筛选方法下，可以得到强度不同的启动子。通过对酿酒酵母组成型启动子进行随机突变得到了一个强度范围差别15倍的突变启动子库。2）启动子间隔区的饱和突变，对启动子的间隔区进行饱和突变是一种十分有效的方法用于改变启动子的结构从而构建合成启动子文库。通过对大肠杆菌启动子的-35和-10保守区之间和周围的间隔区进行饱和突变可以得到强度不同的启动子。在乳酸链球菌的启动子的间隔区进行饱和突变后可以得到一个强度范围在400倍的人工启动子文库。3）启动子的杂交，启动子杂交的主要目的是将真核生物启动子的增强组件与核心启动子进行融合从而可以理性的增强启动子的转录水平并调控启动子的功能。通过这种启动子杂交的方式构建可以得到启动子强度差异90倍的启动子文库。这种方法除了可以应用在组成型启动子上外，还可以将诱导型启动子的调节元件也进行融合，使组成型的启动子改造成诱导型的启动子。 

在启动子的序列内存在一些转录因子结合位点，细胞内的转录因子通过这些结合位点可以与启动子发生相互作用，增强启动子的强度。通过将这些转录因子结合位点插入到启动子 中可以人为的调节启动子的强度，为启动子强度的调控提供技术方法。 

发明内容

本发明的目的是为解决基因表达过程中启动子强度难以调节的问题，提供一种利用转录因子结合位点调节启动子强度的方法。 

为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种利用转录因子结合位点调节启动子强度的方法，从酿酒酵母启动子FBA1p中克隆得到一段含有转录因子Rap1、Gcr1和Gcr2结合位点的核酸序列，通过OE-PCR的方法将这段序列与启动子融合可以调节启动子的强度。 

本发明的调节启动子强度的方法，具有以下优点： 

1、本发明创建的方法可以有效的调节启动子的强度，有利于外源基因在代谢工程中的表达。 

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 

实施例1：转录因子结合位点增强启动子ENO2p的强度 

1、从GenBank中查询酿酒酵母基因组中的XI号染色体（GenBank ID:BK006944.2），克隆出FBA1基因（GenBank ID:DAA09097.1）上游-495到-360区域的序列，此序列为含有转录因子Rap1、Gcr1和Gcr2结合位点的核酸序列。 

引物序列为： 

引物1：5’>CACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGAATGTGTGGG TCATTACGTA<3’，下划线序列为与所用的线性质粒pRS41H的重叠序列。