[发明专利]一种寡核苷酸和可消除质粒共转化用于大肠杆菌必需基因点突变的方法有效
| 申请号： | 201410089063.9 | 申请日： | 2014-03-12 |
| 公开（公告）号： | CN103849640A | 公开（公告）日： | 2014-06-11 |
| 发明（设计）人： | 尚广东;骆希;张青;杨晨;花月 | 申请（专利权）人： | 南京师范大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70 |
| 代理公司： | 南京知识律师事务所 32207 | 代理人： | 卢亚丽 |
| 地址： | 210046 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 寡核苷酸 消除 质粒 转化 用于 大肠杆菌 必需 基因 突变 方法 | ||
1.一种利用寡核苷酸和可消除的质粒共转化用于对大肠杆菌基因组上的必需基因进行点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：将寡核苷酸和可消除的质粒pLS1755共转化至表达重组酶的大肠杆菌;筛选氨苄青霉素抗性菌株，再从氨苄青霉素抗性菌株中筛选寡核苷酸发生重组而实现的点突变菌株；然后将再消除点突变菌株中的质粒pLS1755；所述寡核苷酸长度为91个碱基，第46个碱基为突变位点，寡核苷酸的前面四个碱基以硫磷酰基连接；所述质粒pLS1755通过以下构建得到：以pST98-AS为模板，正向引物含酶切位点、50bp LacZ片段和18个碱基的I-SceI酶切位点，反向引物含酶切位点和18个碱基的I-SceI酶切位点，PCR扩增得到tetR-ptetA-I-SceI的片段，酶切后克隆至R6K复制子和氨苄青霉素抗性基因的载体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，可消除的质粒pLS1755含50bp与lacZ基因的同源序列、氨苄青霉素抗性基因、可诱导表达的I-SceI基因以及两个I-SceI酶切位点，复制子为R6K。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在氨苄青霉素抗性的菌株中筛选寡核苷酸发生重组而实现的点突变菌株的方法是：随机挑选氨苄青霉素抗性克隆，分别以之为模板，以根据目的位点两侧的序列所设计的引物进行菌落PCR，对获得的PCR产物，以一端PCR引物进行测序，通过序列分析筛选得到目的位点发生突变的克隆。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消除点突变菌株中质粒pLS1755的方法是：培养液中加入热失活的氯四环素诱导I-SceI基因的表达，I-SceI作用于由于pLS755整合至大肠杆菌基因组而获得的两个I-SceI酶切位点，造成大肠杆菌基因组的双链断裂，此时菌株利用自身的重组系统，催化两个50bp LacZ片段之间的同源重组而去除pLS755部分。
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