[发明专利]一种寡核苷酸和可消除质粒共转化用于大肠杆菌必需基因点突变的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种利用寡核苷酸和可消除的质粒共转化来实现大肠杆菌必需基因点突变的方法。

背景技术

大肠杆菌是研究的最为透彻，也是具有重要生物学用途和工业实践用途的微生物菌株。必需基因指对生物体生存所必需的一类基因。大肠杆菌基因组上的必需基因的点突变是研究基因功能、改变基因所表达的酶的催化特征以及构建新的基因工程菌株的重要手段。

经典的必需基因点突变的方法是首先在构建一个含点突变片段的重组克隆，突变位点两侧含有用于同源重组的同源片段。所采用的载体常常为需要Pir蛋白进行复制的R6K复制子或者温度敏感型复制子，利用前者不能再大肠杆菌中复制以及后者在高温下不能复制的特点，通过突变位点一侧的同源片段整合至大肠杆菌染色体中。载体仍需含有负筛选标记，如编码蔗糖6-果糖转移酶的sacB基因。利用在培养基中添加10%蔗糖的方法，SacB将蔗糖转化为有毒性的聚蔗糖，这样促使菌体通过突变位点另外一侧的同源片段进行第二次的同源重组而去除质粒骨架。此后，PCR扩增目的区域，通过序列测定来确认获得点突变的菌株。此方法步骤繁琐耗时，涉及多个基因克隆的步骤，且最后一步筛选时，可能恢复至原株的基因型，获得突变菌株的几率相差较大。而在必需基因突变时，获得原株的几率远远大于突变菌株的几率，可能需要筛选大量的克隆才能获得目的的突变菌株。

上世纪末发展并逐渐得到广泛应用的重组工程为大肠杆菌必需基因的点突变提供了新颖的思路。重组工程利用重组酶催化的DNA片段之间的同源重组而进行DNA的修饰和克隆。目前使用广泛的重组酶来自于lambda噬菌体，分别为编码DNA5'→3外切酶的redα基因，Redα作用于双链DNA得到3'端突出的DNA分子；编码DNA单链结合蛋白的redβ基因，Redβ其结合在3'端突出的DNA分子上，Redβ也是关键的重组酶，即催化同源片段之间同源重组；redγ基因编码抑制内源性核酸酶的Gam蛋白，Gam保护外源的DNA片段免受内源性DNA酶的降解。与较传统的DNA克隆和修饰相比，重组工程最为显著的优点表现在：可催化短至36个碱基的同源片段之间的同源重组，而短的碱基可通过化学合成的PCR引物来获得，无需多个基因克隆的步骤，这就大大简化了操作流程；可同时针对多个基因、多个位点修饰进行操作。

对单链寡核苷酸而言，单独的redβ基因即可行使重组功能。利用寡核苷酸对大肠杆菌基因组进行修饰而实现必需基因的点突变是近年来发展的手段。但由于没有筛选标记，突变效率一般极低（常在0.1%以下），难以通过常规的方法筛选得到，需要昂贵的高通量仪器和大量筛选才能运用此手段。有研究人员利用两个寡核苷酸共转化的方法来实现突变，一个为突变寡核苷酸，另外一个为与基因组上位点重组后可行使正筛选（如抗生素抗性）的寡核苷酸。但这个突变位点需预先引入，且不能重复使用，这就制约了多重突变。

本专利申请的研究人员曾提出利用重组工程手段，首先通过PCR引入抗性基因盒，再通过巨型核酸酶I-SceI介导的双链断裂修复的方法实现基因组的点突变（专利公开号：CN102703424A）。虽然有着较高的突变效率，但此方法对必需基因的修饰则方法难以实行，因为引入抗性基因将破坏必需基因的开放阅读框而使基因失活，菌株不能生存。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种通过寡核苷酸和可消除的质粒共转化对大肠杆菌必需基因点突变的方法。

具体的实验原理如下。将前面四个碱基以硫磷酰基连接的、长度为91个碱基、中间为突变位点的寡核苷酸和可消除的质粒pLS1755共转化至表达重组酶的大肠杆菌。磷硫酰键连接的核苷酸可避免菌体内部核酸酶的降解。pLS1755含50bp与lacZ基因的同源序列、氨苄青霉素抗性基因，诱导表达的I-SceI基因以及两个I-SceI酶切位点，复制子为R6K。寡核苷酸和共转化至表达重组酶的大肠杆菌时，由于pLS1755不能自主复制，在氨苄青霉素筛选之下，重组酶催化的pLS1755所含的50bp和基因组上同源片段发生同源重组，得到pLS1755整合型菌株。寡核苷酸也同时为重组酶的底物，因此在氨苄青霉素抗性、pLS1755整合的菌株中，含有一定比例的突变菌株。如此可筛选得到由寡核苷酸突变而引起的必需基因点突变的菌株。