[发明专利]LC3-I抗体的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种LC3-I抗体的制备方法及其应用。

背景技术

自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。自噬是细胞内大分子物质和内源性细胞器的降解系统，是细胞维持稳态的一种机制。自噬不仅能维持细胞内环境的稳态，而且近年来研究表明自噬是先天性免疫应答的重要组成部分，与机体先天性免疫应答有关，其与肿瘤、神经退行性疾病及病原体感染等有极大的关系，可抑制肿瘤细胞的过度增殖，还可通过一系列机制将肿瘤细胞、入侵的病原体降解，清除入侵的病原体，从而维持机体稳定。在自噬发展的过程中，微管相关蛋白1轻链3(LC3)是自噬形成的关键调控分子，研究表明LC3是自噬形成的特异性标志分子，其有pre-LC3、LC3-I、LC3-II三种形式。新合成的pre-LC3经过剪切修饰变成LC3-I胞浆蛋白，接着LC3-I转变为LC3-II，并在Atg5的帮助下定位在自噬体前体的膜上，LC3量变及修饰决定了自噬体的形成。因此建立一种方便、快捷、特异的自噬检测方法具有重要的研究意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种LC3-I抗体的制备方法，其制备的LC3-I抗体可用于自噬检测，作为用于研究自噬的形成及作用机制的工具。

为实现上述目的，本发明采用以下方案进行实施：

一种LC3-I抗体的制备方法，其特征在于，包括如下操作步骤：

S1：抗原LC3-I对纯种BALB／c小鼠进行免疫处理，无菌操作取出脾脏，制备脾细胞悬液待用；

S2：取对数生长的SP2／0骨髓瘤细胞与步骤S1中制得的脾细胞按1∶5的比例混合，加入PEG溶液，SP2／0骨髓瘤细胞与脾细胞融合形成杂交瘤细胞并采用HAT选择培养液进行选择培养，HAT选择培养液维持7～10天后换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液培养；

S3：在步骤S2选择培养期间检测LC3-I抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞，上述杂交瘤细胞接种小鼠腹腔，腹水经纯化后获得抗LC3-I抗体。

具体的步骤为：

以饥饿处理的RAW264.7细胞cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物克隆入原核表达载体后进行表达、纯化，获得LC3-I抗原。

步骤S2中在选择培养期间，每2～3天换一半培养液，杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，开始检测特异性抗体，检测采用酶联免疫吸附试验进行。

自噬不仅能维持细胞内环境的稳态，而且与机体先天性免疫应答有关，自噬可抑制肿瘤细胞的过度增殖，清除入侵的病原体，因此建立一种方便、快捷、特异的自噬检测方法具有重要的研究意义。本发明针对的胞浆型LC3-I是自噬体形成和成熟的关键分子，为研究自噬的形成及作用机制提供了有效的I具。

具体实施方式

以下结合具体实施方式来对本发明作进一步的说明，除特别说明以外，所用的试剂和材料均可以通过商业途径购买得到。

1：LC3-I抗原制备

本发明主要通过研究自噬发生过程中胞浆型LC3-I的定位及含量确定自噬的发生发展。RAW264.7细胞常规培养至对数生长期，弃去培养液，加入Hank’s液饥饿处理3小时，收集细胞，加入1ml TRIzol提取细胞总RNA，以此为模板合成cDNA。cDNA合成后进行PCR反应，反应条件为：94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s；72℃延伸3min，共进行30个循环。扩增产物测序正确后克隆入pQES0L原核表达载体。重组质粒转化宿主菌E.coli DH5α，阳性克隆接种于LB培养液中，加入终浓度为1mmo1／LIPTG进行诱导，诱导后样品进行SDS-PAGE电泳分析。SDS-PAGE结束后电转移至硝酸纤维素膜，抗His单克隆抗体鉴定。表达产物鉴定正确后，将200ml诱导菌离心后收集菌体，超声裂解后，收集上清，采用Invitrogen公司Ni²⁺-NTA蛋白纯化试剂盒，按照Native condition方法对目的蛋白LC3-I进行亲和纯化。

2、免疫动物

纯化的重组蛋白LC3-I与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，制成油包水抗原乳剂，BALB／c小鼠腹腔接种重组蛋白，200μg／只，共免疫四次，第三次免疫结束后一周再加强免疫一次。

3、细胞融合