[发明专利]一株绿脓杆菌用于κ-卡拉胶酶的制备

权利要求书

1.一株绿脓杆菌，其特征在于：所述菌株为绿脓杆菌（Pseudomonas sp.）fjfst-331，已于2013年12月25日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，其保藏号为CCTCC M 2013705。

2.根据权利要求1所述的一株绿脓杆菌，其特征在于：所述绿脓杆菌（Pseudomonas sp.）fjfst-331的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种如权利要求1所述的一株绿脓杆菌的用途，其特征在于：用于制备κ-卡拉胶酶。

4.一株如权利要求1所述的一株绿脓杆菌用于制备κ-卡拉胶酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：

①.   将绿脓杆菌（Pseudomonas sp.）fjfst-331接种到产酶培养基中，250ml三角瓶装30ml产酶培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种菌落，32℃、160r/min摇床培养24h后，取1ml培养液再次接种产酶培养基，32℃、160r/min摇床培养56h，发酵液5000r/min离心10min，去除沉淀，取上清液；

②.   用250ml三角瓶装20ml只含质量分数为0.5%κ-卡拉胶底物的培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种1ml上清发酵酶液，于32℃反应1h，得到含κ-卡拉胶酶的发酵液；

③.   将发酵培养基经过4℃，8000-10000g冷冻离心10-20min之后，取上清液；

④.   将上清液加入质量分数为60%-80%的饱和硫酸铵，加入后继续搅拌1h，放置冰箱沉降过夜，4℃，8000-10000g离心20-40min取沉淀；

⑤.   沉淀置于蒸馏水中透析48h，冷冻干燥后得到粗酶粉，-20℃保存；

⑥.   粗酶用0.02mo/L pH7.5的Tris-HCI缓冲液溶解，滤纸过滤除去不溶性杂质，经阴离子交换色谱Q-sepharose Fast Flow分离，用含有0.1~0.6mol/L NaCI的0.05mol/L pH7.2的Tris-HCI缓冲液进行连续梯度洗脱，流速为1.2ml/min，于280nm检测洗脱液中的蛋白质含量，分布收集洗脱液，4.5ml/管，测定峰位的酶活；

⑦.   将试管中有活性的部分合并进行冷冻干燥，即成κ-卡拉胶酶半成品；

⑧.   将Sephcryl S-100凝胶过滤层析柱用0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl缓冲液平衡后，秤取κ-卡拉胶酶半成品0.05g溶于4mL平衡缓冲液中，6000g低温离心20min后取上清液上层析柱，用0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，控制流速为0.1ml/min。洗脱液经紫外检测并分部收集，4ml/管，分别测定出峰部分试管的酶活，将有活力的部分合并，经充分透析脱盐后，超滤膜浓缩，对浓缩液冷冻干燥，得到κ-卡拉胶酶成品。

5.根据权利要求4所述的一株绿脓杆菌用于制备κ-卡拉胶酶的方法，其特征在于：所述产酶培养基：氯化钠15g、κ-卡拉胶2g、酵母膏1g、无机盐母液100ml、水900ml、pH7.5，其中无机盐母液：NaNO₃ 20g、MgSO₄.7H₂O 5g、K₂HPO₄ 10g、CaC1₂  lg、蒸馏水1L。

6.根据权利要求4所述的一株绿脓杆菌用于制备κ-卡拉胶酶的方法，其特征在于：步骤②所述培养基：κ-卡拉胶5g，蒸馏水1000ml，pH7.5。