[发明专利]一株绿脓杆菌用于κ-卡拉胶酶的制备

说明书

技术领域

  本发明属于生物化工领域，涉及一株绿脓杆菌用于κ-卡拉胶酶的制备方法。 

背景技术

  卡拉胶是由1,3-β-D-吡喃半乳糖和1,4-α-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖，主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等的细胞壁中。根据其二糖单元上所含的硫酸基团的数量和内醚环的有无，可将卡拉胶分为κ-、ι-、γ-、λ-、ξ-、ω-和ν-卡拉胶等类型,工业生产和使用的主要为κ-卡拉胶、ι-卡拉胶和λ-卡拉胶3种。 

卡拉胶是一种海藻硫酸半乳匀多糖，通过化学或生物手段降解和修饰后，获得的半乳低聚糖硫酸醋及其衍生物具有多种生物活性如抗病毒、抗肿瘤、抗凝血等，对人体的细胞免疫和体液免疫功能也具有显著的增强作用。研究显示，卡拉胶及其低聚糖的生物学活性与分子量大小和硫酸根含量密切相关，一般认为，多糖分子量在5000-60000范围具有明显的生物活性，因此经降解后得到的卡拉胶低聚糖硫酸酷有可能成为新型海洋药物的重要来源。 

卡拉胶酶主要来源于假单胞菌Pseudomonas、噬纤维菌Cytophaga、弧菌Vibrio、别单胞菌Alteromonas等。目前利用卡拉胶制备半乳低聚糖硫酸醋的方法主要依赖于化学法。由于化学降解方法存在反应条件不易控制、降解产率低、目的产物不易分离等无法克服的缺点，而酶解法可以最大程度地保护反应底物的活性基团不会在降解过程中受到破坏，从而为药源开发奠定了良好的基础。因此，通过从海藻物质或海洋生物中筛选可以产生卡拉胶酶的细菌成为了国内外的科技工作者的主要方向。 

用微生物法获得卡拉胶酶的研究已经有30余年的研究历史，但迄今为止，仅有为数不多的几种微生物被发现具有生物法制备卡拉胶酶的功能，包括Pseudomonas carrageenovora(MeLean M W et.Journal of Biotechnology,1979)、Cytophaga sp.lk一C783(Sarwar G et.Journal of Biotechnology,1987)、Delesseria sanguinea（Potin P et.Biotechnology and Bioengineering ,1991）、Pseudoalteromonas carrageenovora (Miehel G et.Journal of Fermentation and Bioengineering,1999)、Pseudoalteromonas porphyrae(刘光磊，等海洋微生物多糖水解酶的基因克隆和高效表达，2012)等。因此筛选新的微生物菌种进行酶解法降解卡拉胶成为研究者的新任务。 

发明内容

  本发明的目的是提供一株能高效降解κ-卡拉胶的新菌株并用其制备κ-卡拉胶酶的方法。 

本发明的技术方案：一株筛选自卡拉胶加工厂废石膏的细菌，可用于生产κ-卡拉胶降解酶，其命名为绿脓杆菌（Pseudomonas sp.）fjfst-331，已于2013年12月25日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，其保藏号为CCTCC M 2013705，保藏地址为武汉大学。 

微生物菌株的筛选及鉴定： 

本发明从卡拉胶加工厂取卡拉胶废渣进行卡拉胶降解菌的筛选。将卡拉胶废渣用海水（3%海盐配置）浸泡2d，取上清液加入富集培养基中5℃，160r/min摇床培养3d后，重复操作3次，取0.1ml富集培养也涂布初筛分离培养基28℃倒置培养48h，挑取周围形成明显透明圈和凹坑的菌落划线初筛培养基，培养48h后，挑取单菌落移接传代培养基斜面，获得卡拉胶降解菌纯培养。纯种接到发酵培养液种32℃，160r/min培养2d后检测培养液中κ-卡拉胶酶的活力，最终筛选出目标菌株B-331对其进行生理生化鉴定和16s rDNA序列分析，确定其为绿脓杆菌（Pseudomonas sp.），拟命名为绿脓杆菌（Pseudomonas sp.）fjfst-331。

  用所述的绿脓杆菌（Pseudomonas sp.）fjfst-331生产κ-卡拉胶酶的方法步骤如下：