[发明专利]一种尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的测定方法

权利要求书

1. 一种尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的测定方法，即3-甲基腺嘌呤（3-MeA）、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）的测定方法，其特征在于：包括以下具体步骤：

a、样品前处理：尿液在室温状态下解冻并混合均匀，取4 mL尿液，加入4mL超纯水，加入100 μL混合内标，用水浴锅调节温度到75-85℃，取超纯水稀释至8 mL后的尿液置于固相萃取柱中；

固相萃取用Waters Oasis MCX固相萃取柱，预先用2 mL甲醇、5 mL水溶液活化，上样量为8 mL，用2 mL 10％甲醇/水溶液淋洗，然后用1 mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液洗脱，收集洗脱液并于60 ℃下用氮气吹至干，然后用100 μL水溶液溶解，供LC-MS/MS分离分析；

b、标准工作液的配制：用乙腈配制不同浓度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)标准工作溶液、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）标准工作溶液和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）标准工作溶液；

c、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)标准工作溶液、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）标准工作溶液和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

2.根据权利要求1所述的尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的测定方法，其特征在于：所述混合内标为d₃-3-MeA和 d₅-3-EtA混合溶液，其中d₃-3-MeA为100 ng/ml, d₅-3-EtA为2ng/ml。

3.根据权利要求1所述的尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的测定方法，其特征在于：所述甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液的具体配比为47.5: 47.5: 5。

4.根据权利要求1所述的尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的测定方法，其特征在于：在c步骤中，选取了Waters HILIC色谱柱，规格150 mm x 2.1 mm，2.5 μm，流动相体系选取A:乙腈和B: 10m mol/L甲酸铵/水溶液，A:B为95:5。

5.根据权利要求4所述的尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的测定方法，其特征在于：色谱测定中的洗脱条件：流动相A:乙腈和B: 10m mol/L甲酸铵/水溶液，A:B为95:5；流速0.25 mL/min；柱温25 °C；进样量3 μL，洗脱时间：0 ~ 20 min。

6.根据权利要求1所述的尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的测定方法，其特征在于：质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描方式；喷雾电压为5500 V；雾化气压力为344.5 kPa；气帘气压力为206.7 kPa；辅助雾化气压力为310.0 kPa；离子源温度为500℃；去蔟电压为100 eV；碰撞能为30 eV；驻留时间为100 ms，监测离子对为3-MeA：150→123定量离子对，150→108定性离子对；内标d₃-3-MeA为153→126；3-EtA：164→136定量离子对，164→119定性离子对；内标d5-3-EtA为169→137；3-HOEtA：180→136定量离子对，180→119定性离子对；内标d₅-3-EtA为169→137。