[发明专利]一种尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的测定方法

说明书

 

技术领域：

本发明属于尿液样本的理化检验技术领域，主要涉及尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)DNA加合物的测定技术领域，具体说是一种采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪（LC-ESI-MS/MS）测定尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)的方法。

 

背景技术：

3-烷化腺嘌呤是外源性化合物体内代谢生成的自由基与腺嘌呤结合后的产物。由于尿中内源性3-烷化腺嘌呤本底值低，又能较为准确的反映原型化合物的特性，因此作为生物监测指标广泛用于环境烷基化污染物的生物监测。据报道，尿液中3-烷化腺嘌呤与吸烟水平有较强的相关性，能够用于评价烟气中有害成分亚硝胺的接触水平。

目前，关于尿液中DNA加合物的分析检测方法的报道较多，Prevost等人在1996年报道了使用气相色谱-质谱法(GC-MS)检测3-甲基腺嘌呤，3-乙基腺嘌呤，3-羟乙基腺嘌呤的方法。此方法需要样品化学衍生化前处理过程复杂费时，并且GC-MS法的灵敏度与液相色谱-串联质谱法相差甚远。目前提取、净化、检测尿液基质中3种烷基化加合物（3-甲基腺嘌呤，3-乙基腺嘌呤，3-羟乙基腺嘌呤）的高通量分析方法尚未见报道。

发明内容：

本发明的目的正是基于上述现有技术状况而采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术建立的一种3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)DNA加合物的测定方法。该方法具有快速、准确、灵敏度高等特点，可用于尿液中3-烷化腺嘌呤的定性定量分析。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的测定方法，即3-甲基腺嘌呤（3-MeA）、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）的测定方法，其特征在于：包括以下具体步骤：

a、样品前处理：尿液在室温状态下解冻并混合均匀，取4 mL尿液，加入4mL超纯水，加入100 μL混合内标，用水浴锅调节温度到75-85℃，取超纯水稀释至8 mL后的尿液置于固相萃取柱中, 所述混合内标为d₃-3-MeA和 d₅-3-EtA混合溶液，其中d₃-3-MeA为100 ng/ml, d₅-3-EtA为2ng/ml；

固相萃取用Waters Oasis MCX固相萃取柱，预先用2 mL甲醇、5 mL水溶液活化，上样量为8 mL，用2 mL 10％甲醇/水溶液淋洗，然后用1 mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液(47.5: 47.5: 5)洗脱，收集洗脱液并于60 ℃下用氮气吹至干，然后用100 μL水溶液溶解，供LC-MS/MS分离分析；

b、标准工作液的配制：用乙腈配制不同浓度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)标准工作溶液、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）标准工作溶液和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）标准工作溶液；

c、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)标准工作溶液、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）标准工作溶液和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

色谱条件是：选取Waters HILIC色谱柱（150 mm x 2.1 mm，2.5 μm），流动相体系选取A:乙腈和B: 10m mol/L甲酸铵/水溶液，A:B为95:5。洗脱条件：流动相A：乙腈溶液，pH 4.0，流动相B：10mM甲酸铵/水溶液，A:B为95:5，pH 4.0；流速0.25 mL/min；柱温25 °C；进样量3 μL，洗脱时间：0 ~ 20 min。