[发明专利]一种电子烟烟液体外细胞毒性WST-1测试方法

权利要求书

1.一种电子烟烟液体外细胞毒性WST-1测试方法，其特征在于：包括以下步骤： 

1） 溶液的制备：

（1）细胞培养基：溶剂为RPMI-1640 培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml；

（2）电子烟烟液染毒溶液：

用分析天平对电子烟烟液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液配制最高浓度染毒溶液100mg/ml，其余染毒溶液通过使用细胞培养基溶液对最高浓度染毒溶液进行稀释得到；

（3）WST-1染液： -20 ℃保存，临用前 37 ℃温育融化，避免发生沉淀；

（4）阳性对照：十二烷基硫酸钠（SDS），使用去离子水配制1mg/ml储备液，使用时使用细胞培养基，稀释至最终染毒浓度200μg/ml；

2）细胞样本的处理：

（1）细胞培养：本方法适用于贴壁细胞，包括人肺癌细胞A549细胞和人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞，由于不同细胞系的增殖速率不同，需根据实验所用细胞种类对细胞接种密度进行优化，然后将细胞置于37℃，5％C0₂培养箱中培养，当细胞汇合率达70%-80%时，用胰蛋白酶消化法进行细胞接种；

（2）细胞接种：通过对细胞接种密度进行优化后，向96孔板中（除最外周36个孔）分别接种含有最佳接种密度细胞个数的100ul细胞悬液，将细胞培养板放入细胞培养箱中孵育24小时；

（3）电子烟烟液染毒：细胞培养24 h后，吸去培养液，96孔板（除最外周36孔）每列6孔为一组分别设置为空白对照组、电子烟烟液染毒组和阳性对照组处理，空白对照组每孔加入100μl细胞培养基，电子烟烟液染毒组每孔加入100μl电子烟烟液染毒溶液，阳性对照组每孔加入200μg/ml的SDS溶液，电子烟烟液应设置不少于7个非零染毒浓度，96 孔板的最外周36 个孔中选择其中6个孔加入细胞培养基作为培养基背景对照，再选择6个孔加入最高电子烟烟液染毒溶液作为染毒溶液背景对照，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养24 h；

（4）WST-1染色：电子烟烟液染毒24 h后，每孔加入10μl 经温育的WST-1染液，置于37 ℃、5% CO₂条件下孵育2h，孵育完成后室温下快速振荡1 min，使用酶标仪检测每孔在450 nm波长处的吸光值A₄₅₀；

（5）结果与分析：

吸光值A ：A = A450 nm 

A(空白对照组)=6个平行孔的吸光度平均值

A(培养基背景)=6个平行孔的吸光度平均值

A(染毒溶液背景)=6个平行孔的吸光度平均值

A(阳性对照)=6个平行孔的吸光度平均值

细胞存活率（%）= （A_染毒组-A_{染毒溶液背景}）/ （A_{空白对照组}-A_{培养基背景}）

注：所用SDS阳性对照为100%细胞致死浓度，故A_阳性对照应小于等于0.3。

2.根据权利要求1所述的电子烟烟液体外细胞毒性WST-1测试方法，其特征在于：A549细胞的最佳接种密度为10000个/孔，BEAS-2B细胞的最佳接种密度为20000个/孔。

3.根据权利要求1所述的电子烟烟液体外细胞毒性WST-1测试方法，其特征在于：电子烟烟液细胞毒性浓度的染毒区间应包含10mg/ml-100 mg/ml范围。