[发明专利]一种电子烟烟液体外细胞毒性WST-1测试方法

说明书

  

技术领域

本发明涉及电子烟烟液体外细胞毒性的测定，具体说是基于WST-1（一种水溶性四唑盐）染料分析电子烟烟液染毒后细胞存活率的定量测定方法。 

背景技术

随着人们对“吸烟有害健康”的了解，各国政府均在现行法律规定范围内积极采取和实行有效的立法、行政或其他措施，禁止在公共场所吸烟。2005年，中国签署了世界卫生组织《烟草控制框架公约》。2012年，中国政府发布《中国烟草控制规划（2012-2015年）》，提出创造无烟环境，实施公共场所全面禁烟。室内禁烟措施导致电子烟等新型产品在各国市场上得到迅速增长，消费群体不断扩大。电子烟又名电子尼古丁传送系统。世界卫生组织对电子尼古丁传送系统的官方定义为：电子尼古丁传送系统是一种消费产品，能够向肺传输尼古丁。电子烟一般都由三部分构成：烟杆、雾化器、烟液。近年来，电子烟以“保健”，“戒烟”，“清肺”等为宣传口号，以网络为主要营销途径，在中国地区销量大增。某些电子烟产品还宣称其比传统卷烟的危害性更小。然而目前对电子烟的毒性评价研究较少，相关研究仅使用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐法（MTT法）对电子烟烟液或烟雾的细胞毒性进行评价。但由于MTT经活细胞线粒体脱氢酶转化生产的蓝紫色结晶物需加入二甲亚砜溶解后方能比色检测，操作步骤繁琐，易对实验结果造成影响。而WST-1（一种水溶性四唑盐）染料是一种广泛应用于细胞增殖和细胞存活率的快速高灵敏度检测试剂，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜。WST-1 产生的甲臜是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤，同时WST-1 染料稳定性强，其颜色反应时线性范围宽，灵敏度高，且对细胞无明显毒性。 

电子烟烟液是由烟碱、保润剂、香料等多种物质组成的复杂体系，且毒性较低，在进行电子烟烟液的细胞毒性评价时，需要灵敏度高、快速、简便的试验方法。 

目前，使用WST-1法评价电子烟烟液的细胞毒性还未见文献报道，亟需建立基于WST-1染料的电子烟烟液细胞毒性评价方法，考察市售电子烟产品的细胞毒性。 

发明内容

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，并基于WST-1染料颜色反应的原理，根据电子烟烟液细胞毒性的特点， 建立的一种电子烟烟液体外细胞毒性的测定方法。具有检测通量高，灵敏度高，定量准确等优势。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 

一种电子烟烟液体外细胞毒性WST-1测试方法，其特征在于：包括以下步骤： 

1）         溶液的制备：

（1）细胞培养基：溶剂为RPMI-1640 培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml。

（2）电子烟烟液染毒溶液： 

由于电子烟烟液的主要组成成分包括丙二醇、丙三醇等保润剂，导致电子烟烟液溶液密度较大，无法准确移取体积进行染毒溶液的配制。因此，本发明中使用精度不小于万分之一的分析天平对电子烟烟液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液配制最高浓度染毒溶液100mg/ml，其余染毒溶液通过使用细胞培养基溶液对最高浓度染毒溶液进行稀释得到。

（3）WST-1染液：-20 ℃保存，临用前 37 ℃温育融化，避免发生沉淀。 

（4）阳性对照：十二烷基硫酸钠（SDS），使用去离子水配制1mg/ml储备液，使用时使用细胞培养基，稀释至最终染毒浓度200μg/ml。 

2）细胞样本的处理： 

（1）细胞培养：本方法适用于贴壁细胞，包括人肺癌细胞A549细胞和人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞。由于不同细胞系的增殖速率不同，需根据实验所用细胞种类对细胞接种密度进行优化。通过观察细胞生长状态筛选适用的细胞培养基。通过大量实验，最终筛选出对两种细胞株均适用的细胞培养基：以1640培养基为溶剂，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml。将细胞置于37℃，5％C0₂培养箱中培养，当细胞汇合率达70%-80%时，用胰蛋白酶消化法进行细胞接种；  

（2）细胞接种：向96孔板中（除最外周36个孔）分别接种含有最佳接种密度细胞个数的100ul细胞悬液，将细胞培养板放入细胞培养箱中孵育24小时。