[发明专利]一种催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的发酵方法

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的发酵方法。

背景技术

丙烯酰胺是一种用途广泛的有机化工原料，以它为单体合成的产品不下百种，其中以聚丙烯酰胺用途最广。聚丙烯酰胺的主要用途是用于油田调整吸水剖面和“三次采油”中，近年来，为适应我国原油“三次采油”对超高分子量聚丙烯酰胺(相对分子质量≥2000万)的需求，丙烯酰胺的生产将有较大的发展。

丙烯酰胺是以丙烯腈为原料水合而成，从20世纪50年代至今，生产工艺先后经历了硫酸水合、铜系催化的化学水合及微生物腈水合酶生物转化3个发展阶段。1973年，法国研究者Galzy及其研究组发现了一种能催化丙烯腈水合停留在丙烯酰胺的微生物BrevbacteriumR312，从而开始了用微生物生产丙烯酰胺的研究。1985年，日本日东公司建成了世界上第一个微生物法生产丙烯酰胺的工业性装置。上海农药所也在1986年从泰山的土壤中找到了一株产腈水合酶的菌株，并开始了微生物法生产丙烯酰胺的研究。腈水合酶是一种可以把腈化合物的腈基进行水合后转变为酰胺基，制造对应的酰胺化合物的微生物的酶，腈水合酶作为催化剂催化丙烯腈水合成丙烯酰胺的方法正成为主流。与铜系催化法相比，微生物法有许多优点：酶催化反应在常温、常压下进行，提高了生产安全性；丙烯腈的转化率接近100%，不需回收未反应原料；由于省去了铜分离工段，产品中不含铜离子，产品纯度高，特别适合生产超高分子量的聚丙烯酰胺；工艺过程简单，设备投资少，生产经济效益高。微生物法催化生产丙烯酰胺是石油化工骨干产品利用酶催化技术成功的第一范例，具有划时代的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的发酵方法，本发明的光敏性腈水合酶菌株是一种恶臭假单胞菌，经传统发酵、催化合成丙烯酰胺，利用本发明菌株合成的丙烯酰胺水合产物浓度高，减少了浓缩的负担，无副产物，产品纯度高，适合工业化生产丙烯酰胺。

本发明所采用的技术方案是：一种催化合成丙烯酰胺的光敏性腈水合酶菌株的发酵方法。

一：催化剂制备

菌体发酵培养：将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)菌体接种于固体培养基，活化后挑取菌苔在摇床中发酵制备腈水合酶，经光照、温度为30℃，摇床转速200r·min^-1，培养96h后得到具有腈水合酶活力的发酵液，且发酵液的总酶活达800～1200万单位/毫升发酵液；

固体培养基配方为：葡萄糖1%、酵母浸膏0.36%、K₂HPO₄ ·3H₂O0.2 %、NaCl 0.1%、MgSO₄ ·7H₂O 0.015%，琼脂2%、余量为脱盐水；

发酵培养基配方为：葡萄糖1～3%，酵母浸膏0.5～1%，谷氨酸0.05～0.1%，尿素0.5～1%，K₂HPO₄·3H₂O0.03～0.1%，KH₂PO₄0.03～0.1%，MgSO₄ ·7H₂O 0.03～0.1%，Fe³⁺ 0.0001～0.003%，pH值7.5～8.5，余量为脱盐水；上述百分比为质量百分比。

上述发酵过程中添加的Fe³⁺为FeCl₃、Fe₂(SO₄)₃、Fe(NO)₃中的任意一种。

上述所述光照条件为培养阶段可见光照射发酵液。

催化剂悬浮液制备：将发酵液在分离因素≥3000离心分离，去上清液，将细胞悬浮于脱盐水中，配成菌体细胞与脱盐水体积比为1：100～1:200的催化剂悬浮液备用。

含有光敏性腈水合酶菌株催化合成丙烯酰胺的方法包括如下步骤：向催化剂悬浮液中缓慢加入丙烯腈，常压，温度为30℃，200r·min^-1的搅拌速度下进行酶催化水合反应，丙烯腈的添加量占反应体系的20～30%（wt），经过一段时间的反应，获得丙烯酰胺溶液；