[发明专利]一种检测玉米赤酶烯酮的方法

权利要求书

1.一种检测玉米赤酶烯酮的方法，具体步骤如下所述：

第一步、制备阳离子化蛋白，主要制备阳离子化牛血清蛋白cBSA和阳离子化鸡卵清蛋白cOVA；

第二步、采用Mannich法制备免疫抗原ZEN-cBSA和检测抗原ZEN-cOVA；

第三步、取健康的6-8周雌性Balb/c小鼠4只，初次免疫用完全弗氏佐剂乳化后腹腔注射，每只鼠免疫剂量为100μg ZEN-cBSA，注射体积为0.2mL；之后加强免疫每两周腹腔注射一次，乳化用不完全弗氏佐剂；最后一次免疫使用生理盐水代替不完全弗氏佐剂，采用尾静脉注射，注射剂量和前面几次相同；一共免疫6次；从第3次免疫开始，每次免疫后10天断尾取血，间接ELISA检测小鼠血清效价；

第四步、小鼠在最后一次免疫后的第10天，摘眼球取血，处死小鼠；所获血液先置于室温下2h，然后在4℃条件下3500rpm离心20min，离心之后的血清冻存于-20℃的冰箱中；

第五步、纯化离心后的血清，间接ELISA确定血清效价；

第六步、检测抗原包被于酶标板上，在4℃条件下过夜；

第七步、使用乙腈-水提取待检样品中的毒素，乙腈与水的体积比为85:15；

第八步、洗涤酶标板，加入封闭液，反应2h；

第九步、洗涤，冻存酶标板；或者加入标准毒素溶液、样品提取液，添加稀释后的血清上清；

第十步、洗涤，加入二抗羊抗鼠IgG-HRP反应；

第十一步、洗涤，加入底物液显色；

第十二步、终止，450nm处酶标仪检测反应孔OD值。

2.根据权利要求1所述的一种检测玉米赤酶烯酮的方法，其特征在于：所述的第二步中制备得到的免疫抗原中ZEN与cBSA的分子个数比的范围为10:1-20:1。

3.根据权利要求1所述的一种检测玉米赤酶烯酮的方法，其特征在于：所述的第三步中初次免疫和加强免疫乳化成功的标准是乳液在水中呈滴状，免疫的抗原剂量为100μg/只。

4.根据权利要求1所述的一种检测玉米赤酶烯酮的方法，其特征在于：所述的第五步中血清效价的判断标准为阳性孔的最大稀释倍数，而阳性孔的判断标准为（A_待检样品-A_空白）/（A_阴性-A_空白）>=2.1，其中A为待检孔在450nm条件下的OD值。

5.根据权利要求1所述的一种检测玉米赤酶烯酮的方法，其特征在于：所述的第六步中检测抗原ZEN-cOVA使用100mmol/L pH=9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液稀释到2μg/mL。

6.根据权利要求1所述的一种检测玉米赤酶烯酮的方法，其特征在于：所述第九步中的血清上清按照效价/2的倍数稀释后加入。