[发明专利]一种检测玉米赤酶烯酮的方法

说明书

技术领域

本发明属于一种检测真菌毒素的方法，特别涉及一种检测玉米赤酶烯酮的方法。

背景技术

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是由粉红镰刀菌和其他镰刀菌产生的一种激素类真菌毒素，常见于玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物中，它可引起各种谷物的病变，有类似雌激素的毒作用，可刺激含雌激素受体的乳腺癌细胞增长，导致动物激素水平过高以及严重的生殖问题，还具有潜在的致癌性。目前用于检测玉米赤酶烯酮的方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫法。薄层色谱法检测方便，但检测限高，不能很好的定量；高效液相色谱法检测准确、检测低，但需要复杂的样品前处理过程、专门的仪器以及专业的人员培训；前述的这些方法均存在着一些不足，不能有效快速地测出相应谷物中所含有的玉米赤霉烯酮。

发明内容

本发明的目的是针对现有的检测玉米赤酶烯酮的方法中存在的一些问题而提供的一种检测玉米赤酶烯酮的方法。

本发明所述的检测玉米赤酶烯酮的方法是采用Mannich法制备玉米赤酶烯酮的免疫抗原和检测抗原，免疫Balb/c小鼠，并获得相应的多抗血清，血清经过分离纯化后，间接ELISA检测其效价；然后将检测抗原包被于酶标板上，过夜、封闭，再加入标准毒素溶液、样品提取液，以及稀释后的多抗；反应后，加入羊抗鼠IgG-HRP，再加入底物溶液显色，终止后，在450nm处检测OD值，绘制相关标准曲线，进而求出待测样品中ZEN的含量，具体步骤如下所述：

第一步、制备阳离子化蛋白，主要制备阳离子化牛血清蛋白cBSA和阳离子化鸡卵清蛋白cOVA；

第二步、采用Mannich法制备免疫抗原ZEN-cBSA和检测抗原ZEN-cOVA；

第三步、取健康的6-8周雌性Balb/c小鼠4只，初次免疫用完全弗氏佐剂乳化后腹腔注射，每只鼠免疫剂量为100μg ZEN-cBSA，注射体积为0.2mL；之后加强免疫每两周腹腔注射一次，乳化用不完全弗氏佐剂；最后一次免疫使用生理盐水代替不完全弗氏佐剂，采用尾静脉注射，注射剂量和前面几次相同；一共免疫6次；从第3次免疫开始，每次免疫后10天断尾取血，间接ELISA检测小鼠血清效价；

第四步、小鼠在最后一次免疫后的第10天，摘眼球取血，处死小鼠；所获血液先置于室温下2h，然后在4℃条件下3500rpm离心20min，离心之后的血清冻存于-20℃的冰箱中；

第五步、纯化离心后的血清，间接ELISA确定血清效价；

第六步、检测抗原包被于酶标板上，在4℃条件下过夜；

第七步、使用乙腈-水提取待检样品中的毒素，乙腈与水的体积比为85:15；

第八步、洗涤酶标板，加入封闭液，反应2h；

第九步、洗涤，冻存酶标板；或者加入标准毒素溶液、样品提取液，添加稀释后的血清上清；

第十步、洗涤，加入二抗羊抗鼠IgG-HRP反应；

第十一步、洗涤，加入底物液显色；

第十二步、终止，450nm处酶标仪检测反应孔OD值。

第二步中制备得到的免疫抗原中ZEN与cBSA的分子个数比的范围为10:1-20:1。

第三步中初次免疫和加强免疫乳化成功的标准是乳液在水中呈滴状，不会迅速扩散，免疫的抗原剂量为100μg/只。

第五步中血清效价的判断标准为阳性孔的最大稀释倍数，而阳性孔的判断标准为（A_待检样品-A_空白）/（A_阴性-A_空白）>=2.1，其中A为待检孔在450nm条件下的OD值。

第六步中检测抗原ZEN-cOVA使用100mmol/L pH=9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液稀释到2μg/mL。

第九步中封闭过的酶标板能够直接用于检测玉米赤酶烯酮，血清上清按照效价/2的倍数稀释后加入，也可以冻存于-20℃下，便于以后随时进行检测。

本发明的有益效果：

1、毒素免疫和检测偶联的蛋白选用阳离子化的蛋白，即阳离子化牛血清蛋白（cBSA）和阳离子化鸡卵清蛋白（cOVA），阳离子化蛋白较正常蛋白可以结合更多的毒素分子，同时更有效的利用参加反应的毒素分子，从而节省成本；