[发明专利]一种同位素稀释LA-ICP-MS原位测定生物组织样品中铁含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及无机质谱原位分析技术领域，尤其涉及一种同位素稀释LA-ICP-MS原位测定生物组织样品中铁含量的方法。

背景技术

激光剥蚀电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)是在质谱检测的基础上结合激光剥蚀进样技术而成的一种固体微区分析新技术。该技术固体进样前处理相对简单，引入等离子体的干气溶胶较湿法进样干扰少，且其原位(in-situ)、微区、快速的分析优势，以及高灵敏度、低检出限、小于10μm空间分辨率、可进行多种元素含量和同位素组成测量的能力已成为生物医学研究中一种很有潜力的分析方法，近年来已成为质谱分析技术应用的前沿。在生物临床领域中的应用报道中，研究对象涉及植物、动物脑和其他生物组织切片样品等。然而，LA-ICP-MS技术在生物临床领域的应用中，由于目前与待测样品基体相匹配的标准物质或标准样品还十分匮乏，而该技术本身受样品基体效应、分馏效应、质量歧视效应影响又十分严重，导致LA-ICP-MS在准确定量测量方面存在较大困难。现阶段大多数LA-ICP-MS应用研究集中在对元素含量的相对测量，即用相对计数表示含量的大小，不能给出绝对量值，难以满足生物医学研究中对生物组织样品原位、微区元素分布准确定量分析的要求。

同位素稀释质谱法(IDMS)是国际公认的高准确度分析方法之一，如果能将灵敏、准确的同位素稀释技术与可以实现原位、微区分析的LA-ICP-MS相结合，将为解决LA-ICP-MS进行生物样品原位微区准确定量元素测量提供一条理想的途径。目前，基于IDMS技术LA-ICP-MS定量方法研究，主要包括两种方案：第一，固体稀释剂标记技术(solid-spiking for direct analysis)。通过采用溶液稀释剂与固体样品混合、均匀化、干燥等步骤，使稀释剂与固体样品中待测元素发生同位素交换，制备出可用于标记待测固体样品的固体稀释剂，该固体稀释剂可以与待测样品混合、均匀、压片后，用于LA-ICP-MS测量的样品。该方法由于采用了IDMS技术，使得LA-ICP-MS在定量方面的准确性有所提高，减小了测量不确定度，然而却不能应用于组织切片的原位、微区分析。第二，溶液稀释剂在线引入技术。即通过溶液稀释剂在线引入到激光剥蚀样品池，在池中与剥蚀固体样品产生的气溶胶混合并发生同位素交换，混合气溶胶引入到ICP-MS中进行测量。这种方式制样过程相对简单，适用性较强，没有样品与稀释剂之间混合、均匀化的过程，因此可应用于组织切片样品的原位、微区定量分析。然而，此方法在应用中还存在两个技术难点，一是如何确定与待测样品发生反应的稀释剂质量；二是如何确定稀释剂与样品之间的同位素交换是否达到平衡。因此，迄今为止，将IDMS方法与LA-ICP-MS相结合，用于组织切片样品的原位、微区绝对定量分析还未见报道。

发明内容

为解决现有技术中出现的问题，本发明提供了一种同位素稀释LA-ICP-MS原位测定生物组织样品中铁含量的方法。本发明通过对生物切片样品采用组织防脱材料构建样品边界的方式，在边界内加入定量的同位素稀释剂与组织样品进行同位素充分交换；优化了同位素稀释剂的添加方式、同位素平衡时间、以及原位的同位素比测量技术的条件；采用同位素稀释法-LA-ICP-MS技术对实验室自行制备的均匀的山羊脑和牛肝组织切片样品中的铁进行了原位定量测量。本发明具有操作简便、定量结果准确可靠、重现性好等优点，克服了目前生物切片样品中金属元素难以进行原位定量分析的难题，适用于生物切片样品中金属元素的原位绝对定量分析。

本发明所述的方法，包括以下步骤：

(1)山羊脑和牛肝组织切片样品的制备：将山羊脑组织样品经过混合、匀浆，在-20℃下冷冻后，采用全自动冷冻切片机制作20～50μm厚的山羊脑组织切片样品；称取牛肝粉末标准样品分散在30％的明胶水溶液中，涡旋均匀化混合5分钟后，用移液管取样20～50μL滴加到载玻片上，室温下干燥后形成一个模拟的组织切片样品，由载玻片在滴加样品前后分别称重的质量变化得到模拟切片的质量；

(2)组织防脱边界的构建及同位素稀释剂的加入：使用免疫组化笔分别在山羊脑和牛肝组织切片周围绘制一个边界，用移液器往边界内的组织样品上分两次滴加约0.1～0.3g的浓缩⁵⁷Fe稀释剂溶液；