[发明专利]顺式环氧琥珀酸水解酶的固定化方法及其固定化酶

权利要求书

1.一种顺式环氧琥珀酸水解酶的固定化方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将顺式环氧琥珀酸水解酶基因的N末端或C末端与组氨酸标签连接，构建二者的融合表达载体；

（2）将步骤（1）所得融合表达载体转化工程菌，获得重组工程菌；

（3）将步骤（2）所得重组工程菌进行培养及诱导表达，得重组表达工程菌；

（4）收集重组表达工程菌，并进行菌体破碎，固液分离，收集上清液；

（5）步骤（4）所得上清液经过Ni²⁺螯合层析介质进行螯合反应，即得固定化顺式环氧琥珀酸水解酶。

2.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，步骤（1）中，所述组氨酸标签由4～8个、优选为6个组氨酸组成；

优选地，所述融合表达载体的基础载体为温度诱导型的pBV220载体。

3.根据权利要求1或2所述的固定化方法，其特征在于，步骤（2）所述工程菌为大肠杆菌E.coli。

4.根据权利要求1-3任一项所述的固定化方法，其特征在于，步骤（3）中，所述培养为将重组工程菌于30～37℃下、优选35～37℃下、更优选37℃下培养至OD600为0.6～1.0、优选为0.7～0.9、更优选为0.8；

优选地，所述诱导表达为：将培养温度升至40～42℃、优选42℃，诱导培养4～6h，优选为5h。

5.根据权利要求1-4任一项所述的固定化方法，其特征在于，步骤（4）中，所述菌体破碎采用高压细胞破碎、超声波破碎或溶菌酶破碎中的任意一种，优选采用超声波破碎；

优选地，在所述菌体破碎前，用磷酸盐缓冲液洗涤所述菌体；进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2～7.6、优选为7.4，浓度为18～22mM、优选20mM；

优选地，所述固液分离通过离心进行；进一步优选地，所述离心条件为：2～8℃、优选4℃下，以8,000～12,000g、优选10,000g的转速离心15～30min，优选20min。

6.根据权利要求1-5任一项所述的固定化方法，其特征在于，步骤（5）中，所述Ni²⁺螯合层析介质的固相载体为琼脂糖、葡聚糖或者纤维素中的任意一种，优选的是琼脂糖微球固相载体；

优选地，在所述上清液经过Ni²⁺螯合层析介质前，所述Ni²⁺螯合层析介质先用含0.08～0.12M、优0.1M NaCl的磷酸盐缓冲液进行平衡；进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2～7.6、优选为7.4，浓度为18～22mM、优选20mM；

优选地，在所述上清液经过Ni²⁺螯合层析介质后，用磷酸盐缓冲液进行洗涤；进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2～7.6、优选为7.4，浓度为18～22mM、优选20mM。

7.一种固定化顺式环氧琥珀酸水解酶，其特征在于，由权利要求1～6任一项所述制备方法制得。

8.一种生产手性酒石酸或其盐的方法，其特征在于，顺式环氧琥珀酸或其盐在权利要求7所述固定化顺式环氧琥珀酸水解酶的作用下发生酶解反应而得；

优选地，所述酶解反应的温度为30～40℃、优选为32～38℃、更优选为37℃；

优选地，所述酶解反应的pH值为7～9、优选为8；

优选地，所述手性酒石酸盐为手性酒石酸钠、手性酒石酸钾、手性酒石酸钾钠或手性酒石酸氢钾；

优选地，所述手性酒石酸或其盐为L型或D型。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述固定化顺式环氧琥珀酸水解酶装填层析柱；然后将pH为7～9、优选为8的顺式环氧琥珀酸或其盐的水溶液上样至所述层析柱进行酶解反应，反应期间将层析柱的温度控制在30～40℃、优选32～38℃、更优选37℃；最后收集反应液即得。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述顺式环氧琥珀酸或其盐的水溶液的浓度为0.8～1.6M、优选为1.0～1.4M、更优选为1.2M。