[发明专利]顺式环氧琥珀酸水解酶的固定化方法及其固定化酶在审

专利信息
申请号: 201410098975.2 申请日: 2014-03-17
公开(公告)号: CN103882000A 公开(公告)日: 2014-06-25
发明(设计)人: 王云山;王自强;李彦良;苏志国 申请(专利权)人: 中国科学院过程工程研究所
主分类号: C12N11/12 分类号: C12N11/12;C12N11/10;C12N9/14;C12N15/70;C12P7/46
代理公司: 北京品源专利代理有限公司 11332 代理人: 巩克栋;侯桂丽
地址: 100190 *** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 顺式 琥珀酸 水解 固定 方法 及其
【说明书】:

技术领域

发明涉及生物工程领域,尤其涉及一种顺式环氧琥珀酸水解酶的固定化方法,其固定化酶,以及基于该固定化酶生产手性酒石酸或其盐的方法。

背景技术

随着手性药物在临床上的不断应用,手性药物的拆分技术也日趋完善。手性酒石酸作为一种重要的手性拆分剂,有着良好的市场前景及应用价值。目前,在抗结核药乙胺丁醇的生产过程中,L-(+)-酒石酸作为唯一的、不可替代的手性拆分剂已取得成功应用。同时,以手性酒石酸为前体的一些酒石酸衍生物类药物也已经进入临床,如酒石酸美托洛尔片。此外,手性酒石酸也是重要的食品添加剂和化工原料,广泛应用于食品、印染、电镀、皮革等领域。

手性酒石酸的生产方法主要有提取法、化学拆分法、糖质发酵法和酶法合成四种。其中,酶法合成以石油化工产品马来酸为初始原料,通过过氧化氢环氧化制成顺式环氧琥珀酸盐,然后在L-(+)-型或D-(-)-型顺式环氧琥珀酸水解酶(ESH)的作用下水解生成L-(+)-型或D-(-)-型酒石酸。自1974年日本学者佐藤英次等首次报道可采用酶法制备L-(+)-酒石酸以来,由于其转化率高、专一性强、安全性好等优点,已经应用于L-(+)-酒石酸的工业生产。

目前已报道的ESH生产菌种有:假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)、根瘤菌(Rhizobium validum)、产碱杆菌(Alcaligenes sp.)、棒状杆菌(Corynebacterium sp.)、诺卡氏菌(Nocardia tartaricans)、红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、无色杆菌(Achromobaeter sp.),其中棒状杆菌和诺卡式菌是L-(+)-酒石酸的工业生产用菌种。由于游离细胞催化时ESH的表观活性很低,导致了酶的催化效率很低。毛庆静研究了N.tartaricans细胞膜通透性对ESH表观酶活的影响,结果表明,N.tartaricans细胞经超声波破碎后,ESH活性比完整细胞提高了40倍以上,但是细胞破碎后内源蛋白酶会影响ESH的稳定性(华东理工大学学报,2003,29(3):264-267)。Rosenberg等人研究了表面活性剂对ESH表观酶活的影响,发现N.tartaricans细胞经0.02%(w/v)脱氧胆酸钠处理后,ESH表观活性可提高20倍(Biotechnol.Lett,1999,21:491-495)。

为了进一步提高酶的催化效率及利用率,将细胞固定化技术引入了L-(+)-酒石酸的生产过程。孙志浩等首次采用明胶包埋N.tartaricans,得到ESH活力较高的固定化细胞(生物工程学报,1995,11(4):372-376)。张建国等以卡拉胶为载体固定化Corynebacterium sp.JZ-1菌株细胞,活化处理后ESH酶活力的总回收率在100%以上,且热稳定性、pH稳定性均得以提高,1500L酶柱中连续运行90d,ESH酶活基本保持不变(生物工程学报,2000,16(2):188-192)。Vikartovská等将含ESH的N.tartaricans ATCC31191细胞用果胶酸钙微囊固定化,固定化后ESH的表观酶活力为75.8U/mg干细胞(Artif.Cells Blood Substit.Immobil.Biotechnol,2004,32(1):77-89)。之后,等采用藻酸钠-硫酸纤维素-聚乙烯(SA-CS/PMCG)微囊固定化N.tartaricans,研究发现,此法可进一步提高N.tartaricans ESH的表观活性(91.5U/mg干细胞),缩短生物转化时间,提高L-(+)-酒石酸的生产效率(Enzyme Microb.Technol,2005,36:118-126)。

与游离细胞相比,固定化细胞有效克服了酶利用率低、催化效率低等缺陷,但仍无法彻底解除细胞膜的扩散屏障作用。近年来发展起来的固定化酶反应器不仅可以解决细胞膜的扩散限制效应,还可以显著提高酶的稳定性和催化效率。崔球等将ESH基因和碳水化合物结合模块CBM30融合表达,然后将ESH固定化在纤维素介质上,提高了ESH的稳定性(CN102703419A)。但由于CBM模块自身的序列和结构差异,导致了其对不同蛋白质(或酶)分子的影响不同,因此适用性较差。

发明内容

针对上述现有技术的缺陷,本发明的目的在于提出一种酶活性收率高、稳定性好的顺式环氧琥珀酸水解酶的固定化方法、其固定化酶以及基于该固定化酶生产手性酒石酸或其盐的方法。

为了达到上述目的,本发明采用以下技术方案:

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